Difference between revisions of "Team:TecCEM/Experiments"

Line 10: Line 10:
 
             <h3>Project/ Experiments</h3>
 
             <h3>Project/ Experiments</h3>
 
         </div>
 
         </div>
−
         <a href="#experimentsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-offset="100" data-change="sidienu">
+
         <a href="#experimentsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 
             <span data-change="el" class="d-inline-block open"></span>
 
             <span data-change="el" class="d-inline-block open"></span>
 
             Index
 
             Index
Line 19: Line 19:
 
             </li>
 
             </li>
 
             <li>
 
             <li>
−
                 <a href="#protocolsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-offset="100" data-change="sidienu">
+
                 <a href="#proteinSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 
                     <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 
                     <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
−
                     Protocols
+
                     Protein
 
                 </a>
 
                 </a>
−
                 <ul class="collapse list-unstyled" id="protocolsSubmenu">
+
                 <ul class="collapse list-unstyled" id="proteinSubmenu">
 
                     <li>
 
                     <li>
−
                         <a href="#proteinSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-offset="100"
+
                         <a href="#chitosan" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
−
                            data-change="sidienu">
+
 
                             <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 
                             <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
−
                             Protein
+
                             Chitosan
 
                         </a>
 
                         </a>
−
                         <ul class="collapse list-unstyled" id="proteinSubmenu">
+
                         <ul class="collapse list-unstyled" id="chitosan">
 
                             <li>
 
                             <li>
−
                                 <a href="#chitosan" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-offset="100"
+
                                 <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
−
                                    data-change="sidienu">
+
                            </li>
−
                                    <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
+
                            <li>
−
                                    Chitosan
+
                                <a data-target="#encapsulation-efficiency">Protein encapsulation efficiency
−
                                </a>
+
                                    protocol</a>
−
                                <ul class="collapse list-unstyled" id="chitosan">
+
                            </li>
−
                                    <li>
+
                            <li>
−
                                        <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
+
                                <a data-target="#liberation-and-stability">Protein liberation and stability
−
                                    </li>
+
                                    protocol</a>
−
                                    <li>
+
−
                                        <a data-target="#encapsulation-efficiency">Protein encapsulation efficiency
+
−
                                            protocol</a>
+
−
                                    </li>
+
−
                                    <li>
+
−
                                        <a data-target="#liberation-and-stability">Protein liberation and stability
+
−
                                            protocol</a>
+
−
                                    </li>
+
−
                                </ul>
+
 
                             </li>
 
                             </li>
 
                         </ul>
 
                         </ul>
 +
                    </li>
 +
                </ul>
 +
            </li>
 +
            <li>
 +
                <a href="#reactantsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                    <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                    Reactants
 +
                </a>
 +
                <ul class="collapse list-unstyled" id="reactantsSubmenu">
 +
                    <li>
 +
                        <a data-target="#liberation-and-stability">Protein liberation and stability
 +
                            protocol</a>
 +
                    </li>
 +
                </ul>
 +
            </li>
 +
            <li>
 +
                <a href="#nucleicSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                    <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                    Nucleic Acids
 +
                </a>
 +
                <ul class="collapse list-unstyled" id="nucleicSubmenu">
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#celltransformation" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Cell Transformation
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="celltransformation">
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#enzymerestriction" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Enzyme restriction
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="enzymerestriction">
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#pcr" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            PCR
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="pcr">
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#plasmidextraction" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Plasmid extraction
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="plasmidextraction">
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                </ul>
 +
            </li>
 +
            <li>
 +
                <a href="#cellSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                    <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                    Cell
 +
                </a>
 +
                <ul class="collapse list-unstyled" id="cellSubmenu">
 +
                    <li>
 +
                        <a data-target="#celllineessays">Cell line essays</a>
 
                     </li>
 
                     </li>
 
                 </ul>
 
                 </ul>
Line 81: Line 182:
 
                     </a>
 
                     </a>
 
                     <div class="collapse" id="encapsulation">
 
                     <div class="collapse" id="encapsulation">
−
                        <div class="mb-3">
+
 
−
                            <h4>Reactants</h4>
+
−
                            <ul>
+
−
                                <li>Chitosan low molecular weight from Sigma-Aldrich</li>
+
−
                                <li>TPP from Sigma-Aldrich</li>
+
−
                                <li>NaOH 1M</li>
+
−
                                <li>Acetic acid 1M</li>
+
−
                                <li>Distilled water</li>
+
−
                                <li>Protein of interest (10 mg/mL)</li>
+
−
                            </ul>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h4>Procedure</h4>
+
−
                            <h5><i>Stock solutions</i></h5>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>In a 15 mL Falcon tube add 30 mg of chitosan and 10 mL of distilled water (to get a
+
−
                                    solution with a concentration of 3 mg/mL).</li>
+
−
                                <li>Add 10 microliters of acetic acid for each mL of chitosan solution to solubilize
+
−
                                    the
+
−
                                    chitosan.
+
−
                                    To adjust the pH acetic acid and NaOH should be used.</li>
+
−
                                NOTE: the pH should be adjusted depending on your protein of interest, taking into
+
−
                                account
+
−
                                the isoelectric point, always maintaining the chitosan solution positively charged (pH
+
−
                                &lt;
+
−
                                6.5)
+
−
                                and the protein of interest negatively charged (preferred).
+
−
                                <li> In another 15 mL falcon
+
−
                                    tube add 10 mg of TPP and 10 mL of distilled water (to get a concentration of 1
+
−
                                    mg/mL).</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h5><i>
+
−
                                    Nanoparticle preparation
+
−
                                </i></h5>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>In a 20 mL beaker add 1 mL of chitosan solution and 100 uL of your protein, stir
+
−
                                    the
+
−
                                    mix at 1100 rpm with a magnetic stirrer (the size of nanoparticles is affected by
+
−
                                    rpm
+
−
                                    value; for smaller nanoparticles use higher rpm).</li>
+
−
                                <li>Take 1 mL of the TPP solution and add it to the mix dropwise.</li>
+
−
                                <li>Continue stirring for 1 hour.</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h5><i>
+
−
                                    Particle collection
+
−
                                </i></h5>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Transfer the mix to 2 1.5 mL Eppendorf tubes.</li>
+
−
                                <i>NOTE: If nanoparticles are to be extracted centrifuge the tubes at 20,000 rpm for
+
−
                                    30
+
−
                                    minutes at 4°C.</i>
+
−
                                <li>Eliminate the supernatant.</li>
+
−
                                <li>The pellet will contain your protein of interest.</li>
+
−
                                <li>If nanoparticles are to be used for liberation measurients or suspended in a
+
−
                                    controlled pH solution, resuspend well and store at 4 °C.</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h5> <i>
+
−
                                    To preparation
+
−
                                </i></h5>
+
−
                            <p><i>To visualize chitosan nanoparticles some previous preparation steps must be carried
+
−
                                    out
+
−
                                    (this preparation protocol may vary).</i></p>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>A film of Formvar has to be previously prepared and used to coat a glass slide for
+
−
                                    the
+
−
                                    creation of an 80-120 μm thick mibrane.</li>
+
−
                                <li>Place a copper grid on the Formvar mibrane for it to be absorbed and later rioved
+
−
                                    with a needle.</li>
+
−
                                <li>Add 20 μL of your solution of interest into the grid and let it be absorbed. Add a
+
−
                                    solution of 1% (w/v) phosphotungstic acid until the sample dries.</li>
+
−
                                <li>View in a transmission electron microscope.</li>
+
−
                                <i>NOTE: Samples were observed at 150,000x.</i>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
Line 171: Line 193:
 
                     </a>
 
                     </a>
 
                     <div class="collapse" id="encapsulation-efficiency">
 
                     <div class="collapse" id="encapsulation-efficiency">
−
                        <p>
+
 
−
                            This protocol will evaluate and standardize encapsulation efficiency when working with a
+
−
                            specific
+
−
                            protein. It is highly recommended to work with a highly purified protein sample, so as to
+
−
                            get the
+
−
                            most reliable quantification. Measurients are performed according to the Bradford assay.
+
−
                        </p>
+
−
                        <p>
+
−
                            <i>
+
−
                                Detection range: 0.1-1.4 mg/mL
+
−
                            </i>
+
−
                        </p>
+
−
                        <p>NOTE: Bradford reactant must be at room tiperature and shaken gently before starting
+
−
                            the
+
−
                            protocol.
+
−
                        </p>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h4>
+
−
                                <i>
+
−
                                    Calibration curve of BSA
+
−
                                </i>
+
−
                            </h4>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h5> BSA Stock solution</h5>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Prepare 10 mg/mL BSA solution</li>
+
−
                                <li>Store in ice for further use</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h5>Dilutions</h5>
+
−
                            <p>
+
−
                                Loaded and ipty nanoparticles are prepared under the same conditions (agitation,
+
−
                                tiperature, pH,
+
−
                                and reactant concentrations). Thus, we used a sample of ipty encapsulation supernatant
+
−
                                as
+
−
                                a blank
+
−
                                to construct a standard curve to estimate protein encapsulation efficiency. Volumes of
+
−
                                supernatant
+
−
                                were mixed with volumes of BSA stock solution to obtain dilutions of known protein
+
−
                                concentrations.
+
−
                            </p>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Refer to encapsulation protocol to prepare ipty chitosan nanoparticles.</li>
+
−
                                <li>Prepare encapsulation solution aliquots.</li>
+
−
                                <li>Centrifuge samples after splitting the initial encapsulation volume at 13,400 rpm
+
−
                                    for 30
+
−
                                    min.</li>
+
−
                                <li>Supernatant will be used to derive the curve. Do not discard.</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                            <p><i>Prepare dilutions according to the following table and label each tube. A small-scale
+
−
                                    procedure
+
−
                                    was adapted from Sigma Aldrich to perform Bradford assay on the prepared dilutions.</i></p>
+
−
                            <p><i>
+
−
                                    <b>Table 1.</b> Dilutions to derive a standard curve for encapsulation efficiency
+
−
                                    quantification
+
−
                                </i></p>
+
−
                        </div>
+
−
                        <table>
+
−
                            <thead>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Dilution
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        BSA concentration (mg/mL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Volume of BSA stock solution 10 mg/mL (uL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Volume of ipty nanoparticle encapsulation supernatant (uL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Final volume (uL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                </tr>
+
−
                            </thead>
+
−
                            <tbody>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        1
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0.26
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        2.6
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        97.4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        2
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0.52
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        5.2
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        94.8
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        3
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0.78
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        7.8
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        92.2
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        1.04
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        10.4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        89.6
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        5
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        1.4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        14
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        86
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                            </tbody>
+
−
                        </table>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h5>
+
−
                                Experimental procedure</h5>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Place 6.5 μL of each pattern of BSA (0 mg/mL to 1.4 mg/mL) in sterile 0.6 mL tubes.</li>
+
−
                                <li>Add 193.5 μL of Bradford reagent to each tube. The final volume is 200 μL.</li>
+
−
                                <li>Vortex gently.</li>
+
−
                                <li>Incubate 5-45 min at room tiperature (until a change in color is noticeable).</li>
+
−
                                <li>Transfer 50 μL to a spectrophotometer cell.</li>
+
−
                                <li>Blank with the tube of null BSA concentration + Bradford reagent.</li>
+
−
                                <li>Take absorbance at 595 nm for the samples and record it.</li>
+
−
                                <li>Derive a standard curve for protein concentration in encapsulation supernatant.</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                            <p><i>Note: There shouldn’t be a time difference higher than 10 minutes between each read.</i></p>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h5><i>
+
−
                                    Efficiency quantification
+
−
                                </i></h5>
+
−
                            <p>
+
−
                                Refer to protein encapsulation protocol here using BSA.
+
−
                                NOTE: Calculate initial protein concentration before stirring and record it.
+
−
                            </p>
+
−
                            <p>
+
−
                                Experimental procedure</p>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Prepare eight 1 mL aliquots of loaded chitosan nanoparticles: four ipty, four
+
−
                                    containing
+
−
                                    the protein of interest.</li>
+
−
                                <li>Centrifuge aliquots at 13,400 rpm for 30 min.</li>
+
−
                                <li>Take 6.5 μL of the supernatant and measure absorbance at 595 nm with 193.5 μL of
+
−
                                    Bradford
+
−
                                    reagent. Riiber to incubate this mix at room tiperature 5-45 minutes (until a
+
−
                                    change of
+
−
                                    color is noticeable).</li>
+
−
                                <li>Record reads and estimate protein concentration in the supernatant using the
+
−
                                    previously
+
−
                                    derived standard curve.</li>
+
−
                                <li>Calculate encapsulation efficiency at this initial time as follows.</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="text-center">
+
−
                            <figure class="figure text-left">
+
−
                                <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/9/99/T--TecCEM--Figure5Improvement.png"
+
−
                                    class="figure-img img-fluid rounded" alt="IMP-1">
+
−
                            </figure>
+
−
                        </div>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
Line 412: Line 204:
 
                     </a>
 
                     </a>
 
                     <div class="collapse" id="liberation-and-stability">
 
                     <div class="collapse" id="liberation-and-stability">
−
                        <p>
+
 
−
                            This protocol will assess the protein release and nanoparticle stability in aqueous
+
−
                            solutions.
+
−
                            We quantified protein liberation by Bradford assay.
+
−
                        </p>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h4> <i>
+
−
                                    Materials
+
−
                                </i>
+
−
                            </h4>
+
−
                            <ul>
+
−
                                <li>PBS pH 7.4</li>
+
−
                                <li>Bradford reagent</li>
+
−
                            </ul>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h4>
+
−
                                <i>
+
−
                                    Standard curve derivation
+
−
                                </i>
+
−
                            </h4>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Use Bradford assay to derive a standard curve for a standard protein (BSA, for
+
−
                                    instance).
+
−
                                </li>
+
−
                                <li>Prepare 6 dilutions from a 10 mg/mL stock solution of the standard protein
+
−
                                    according to
+
−
                                    the
+
−
                                    table. A small-scale procedure was adapted from Sigma Aldrich to perform Bradford
+
−
                                    assay
+
−
                                    on
+
−
                                    the prepared dilutions.
+
−
                                </li>
+
−
                            </ol>
+
−
                            <p>
+
−
                                <i>
+
−
                                    <b>Table 1.</b> Dilutions for standard curve derivation using PBS
+
−
                                </i>
+
−
                            </p>
+
−
                        </div>
+
−
                        <table>
+
−
                            <thead>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Dilution
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Standard protein concentration (mg/mL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Volume of stock solution 10 mg/mL (uL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Volume of PBS pH 7.4 (uL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                    <th>
+
−
                                        Final volume (uL)
+
−
                                    </th>
+
−
                                </tr>
+
−
                            </thead>
+
−
                            <tbody>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        1
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0.26
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        2.6
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        97.4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        2
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0.52
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        5.2
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        94.8
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        3
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        0.78
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        7.8
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        92.2
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        1.04
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        10.4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        89.6
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                                <tr>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        5
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        1.4
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        14
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        86
+
−
                                    </td>
+
−
                                    <td>
+
−
                                        100
+
−
                                    </td>
+
−
                                </tr>
+
−
                            </tbody>
+
−
                        </table>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <ul>
+
−
                                <li>For each dilution mix 6.5 uL of the sample and 193.5 uL of Bradford reactant for a
+
−
                                    final
+
−
                                    volume of 200 uL and leave it react for 20 minutes (Sigma Aldrich suggests 5-45
+
−
                                    minutes).</li>
+
−
                                <li>Read the absorbance of the riaining dilutions using dilution 0 as blank.</li>
+
−
                                <li>Graph absorbance reads vs concentration.</li>
+
−
                                <li>Use a linear trend to get the equation to compute protein concentration evaluating
+
−
                                    correlation coefficient.</li>
+
−
                            </ul>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h4><i>Protein release behavior</i></h4>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Refer to protein encapsulation protocol to prepare enough loaded-nanoparticles for
+
−
                                    six
+
−
                                    1 mL
+
−
                                    aliquots (some volume is lost in every transfer).</li>
+
−
                                <li>Centrifuge the total encapsulation volume at 20000 rpm for 20 minutes.</li>
+
−
                                <li>Discard supernatant.</li>
+
−
                                <li>Resuspend pellet in a volume of PBS pH 7.4 equal to the original volume.</li>
+
−
                                <i>NOTE: Given the low solubility of chitosan in neutral pH solutions, some protocols
+
−
                                    iploy
+
−
                                    mild to moderate sonication to disrupt possible non-dissolved pellet.</i>
+
−
                                <li>Prepare aliquots as previously stated.</li>
+
−
                                <li>Refer to protein encapsulation protocol to prepare enough ipty nanoparticles for
+
−
                                    six 1
+
−
                                    mL
+
−
                                    aliquots (some volume is lost in every transfer).</li>
+
−
                                <li>Centrifuge the total encapsulation volume at 20000 rpm for 20 minutes.</li>
+
−
                                <li>Discard supernatant.</li>
+
−
                                <li>Resuspend pellet in a volume of PBS pH 7.4 equal to the original volume.</li>
+
−
                                <li>Prepare aliquots as previously stated.</li>
+
−
                                <li>Label all aliquots to measure thi at time 0, 2, 4, 6, 12, 24, and 48 h. Store at 37
+
−
                                    °C
+
−
                                    and
+
−
                                    100 rpm.</li>
+
−
                                <li>At the right time, centrifuge the aliquots at 20000 rpm for 20 minutes.</li>
+
−
                                <li>Take 193.5 μL of Bradford reagent and mix with 6.5 μL of centrifugation
+
−
                                    supernatant.
+
−
                                    Vortex
+
−
                                    gently.</li>
+
−
                                <li>Incubate tube at room tiperature for 20 minutes.</li>
+
−
                                <li>Transfer 50 μL to a spectrophotometer cell.</li>
+
−
                                <li>Measure absorbance and calculate protein concentration in the supernatant using the
+
−
                                    previously derived standard curve. Blank should be PBS pH 7.4 + Bradford reagent as
+
−
                                    stated
+
−
                                    above.</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <p><i>NOTE: to achieve a time-efficient protocol, a previous standardization of protein
+
−
                                encapsulation
+
−
                                efficiency is strongly suggested (refer to protein encapsulation efficiency
+
−
                                protocol).
+
−
                                Since
+
−
                                you already know your protein encapsulation efficiency, protein liberation
+
−
                                calculations
+
−
                                may
+
−
                                be
+
−
                                performed as follows.</i></p>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
Line 648: Line 215:
 
                     </a>
 
                     </a>
 
                     <div class="collapse" id="nanoparticle">
 
                     <div class="collapse" id="nanoparticle">
−
                        <p>
+
 
−
                            When studying the nanoparticle behavior in a certain environment several studies are
+
−
                            carried out to assess particle stability throughout time. Such procedures comprise Z
+
−
                            potential measurient and visual examination of size, shape, and particle physical
+
−
                            integrity. A stability monitoring is suggested as particles may change their shape,
+
−
                            degrade, and conglomerate when subjected to different stimuli. Such a study is helpful
+
−
                            to
+
−
                            predict the behavior of the created nanoparticles throughout time and greatly improves
+
−
                            the
+
−
                            design of drug release experiments. Here we include a suggested simple procedure to
+
−
                            visually evaluate particle sizes and integrity. You can also use a Z potential
+
−
                            measurient
+
−
                            equipment, or NanoSight NS300, as we did.</p>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h4><i>Transmission electron microscopy</i></h4>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Refer to protein encapsulation protocol to prepare a final volume of 2 mL
+
−
                                    chitosan
+
−
                                    nanoparticles (loaded or ipty).</li>
+
−
                                <li>Store at the desired conditions.</li>
+
−
                                <li>Perform Ti preparation procedure on a 100 μL sample.</li>
+
−
                                <li>At relevant times observe to evaluate nanoparticle integrity (size,
+
−
                                    conglomeration,
+
−
                                    and shape).</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div class="mb-3">
+
−
                            <h4><i>NanoSight</i></h4>
+
−
                            <ol>
+
−
                                <li>Refer to protein encapsulation protocol to prepare a final volume of 2 mL
+
−
                                    chitosan
+
−
                                    nanoparticles (loaded or ipty).</li>
+
−
                                <li>Store at the desired conditions.</li>
+
−
                                <li>Dilute samples if required.</li>
+
−
                                <li>At relevant times evaluate nanoparticle size distribution (statistical data
+
−
                                    provided in the analysis sheet is useful to evaluate particle behavior).</li>
+
−
                            </ol>
+
−
                        </div>
+
−
                        <p><i>NOTE: Some devices like NanoSight NS500 are able to measure Z potential as well.</i></p>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>

Revision as of 20:49, 17 October 2018

Cell Gif

Experiments

This is our experiment section. Here we compile important protocols for the development of TecTissue, ranging from our bacterial transformation procedures to our cell proliferation assays. We also address cell culture maintenance and protein loaded chitosan nanoparticles. Here you may find the protocol for our growth factor delivery to damaged cells and how much harm can be inflicted in vitro.

Protocols

Chitosan nanoparticles