Difference between revisions of "Team:TecCEM/Experiments"

 
(26 intermediate revisions by 3 users not shown)
Line 1: Line 1:
 
{{TecCEM}}
 
{{TecCEM}}
 
<html>
 
<html>
 +
<style>
 +
    .wrapper .sidebar-index {
 +
            overflow: auto;
 +
        }
 +
    </style>
 
<div id="gif-title" class="text-project">
 
<div id="gif-title" class="text-project">
−
     <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/a/aa/T--TecCEM--Cells.gif" alt="Cell Gif">
+
     <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/4/41/T--TecCEM--Cells--Experiments.gif" alt="Cell Gif">
 
     <h1>Experiments</h1>
 
     <h1>Experiments</h1>
 
</div>
 
</div>
Line 10: Line 15:
 
             <h3>Project/ Experiments</h3>
 
             <h3>Project/ Experiments</h3>
 
         </div>
 
         </div>
−
         <a href="#experimentsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-offset="100" data-change="sidemenu">
+
         <a href="#experimentsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 
             <span data-change="el" class="d-inline-block open"></span>
 
             <span data-change="el" class="d-inline-block open"></span>
 
             Index
 
             Index
Line 16: Line 21:
 
         <ul class="collapse list-unstyled" id="experimentsSubmenu">
 
         <ul class="collapse list-unstyled" id="experimentsSubmenu">
 
             <li class="active">
 
             <li class="active">
−
                 <a data-target="#description">Description</a>
+
                 <a>Description</a>
 
             </li>
 
             </li>
 +
 
             <li>
 
             <li>
−
                 <a href="#protocolsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-offset="100" data-change="sidemenu">
+
                 <a href="#proteinSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
−
                     <span class="d-inline-block open" data-change="el"></span>
+
                     <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
−
                     Protocols
+
                     Protein
 
                 </a>
 
                 </a>
−
                 <ul class="collapse list-unstyled" id="protocolsSubmenu">
+
                 <ul class="collapse list-unstyled" id="proteinSubmenu">
 
                     <li>
 
                     <li>
−
                         <a href="#chitosanSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-offset="100"
+
                         <a href="#chitosan" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
−
                            data-change="sidemenu">
+
 
                             <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 
                             <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
−
                             Chitosan nanoparticles
+
                             Chitosan
 
                         </a>
 
                         </a>
−
                         <ul class="collapse list-unstyled" id="chitosanSubmenu">
+
                         <ul class="collapse list-unstyled" id="chitosan">
 
                             <li>
 
                             <li>
−
                                 <a data-target="#encapsulation">Protein encapsulation protocol</a>
+
                                 <a>Protein encapsulation protocol</a>
 
                             </li>
 
                             </li>
 
                             <li>
 
                             <li>
−
                                 <a data-target="#encapsulation-efficiency">Protein encapsulation efficiency protocol</a>
+
                                 <a>Protein encapsulation efficiency
 +
                                    protocol</a>
 
                             </li>
 
                             </li>
 
                             <li>
 
                             <li>
−
                                 <a data-target="#liberation-and-stability">Protein liberation and stability protocol</a>
+
                                 <a>Protein liberation and stability
 +
                                    protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#polyacrimlamide-gel" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Polyacrilamide gel
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="polyacrimlamide-gel">
 +
                            <li>
 +
                                <a>AB Polyacrilamide gel</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Standard polyacrylamide gel</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#productpurification" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Production/purification
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="productpurification">
 +
                            <li>
 +
                                <a>Criofracture</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Fluorescent protein production</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Protein production/purification
 +
                                    protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#proteicquantification" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Proteic quantification
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="proteicquantification">
 +
                            <li>
 +
                                <a>Bradford</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Lowry</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Pierce BCA</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                </ul>
 +
            </li>
 +
            <li>
 +
                <a href="#cellSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                    <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                    Cell
 +
                </a>
 +
                <ul class="collapse list-unstyled" id="cellSubmenu">
 +
                    <li>
 +
                        <a>In vitro burn essay protocol</a>
 +
                    </li>
 +
                </ul>
 +
            </li>
 +
            <li>
 +
                <a href="#reactantsSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                    <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                    Reactants
 +
                </a>
 +
                <ul class="collapse list-unstyled" id="reactantsSubmenu">
 +
                    <li>
 +
                        <a>Protocol for the creation of lysis buffer P</a>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a>Protocol for the creation of polyacrylamide gel</a>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a>Protocol for the creation of thermal lysis buffer</a>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a>Protocol to make polyacrylamide AB</a>
 +
                    </li>
 +
                </ul>
 +
            </li>
 +
            <li>
 +
                <a href="#nucleicSubmenu" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                    <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                    Nucleic Acids
 +
                </a>
 +
                <ul class="collapse list-unstyled" id="nucleicSubmenu">
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#celltransformation" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Cell Transformation
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="celltransformation">
 +
                            <li>
 +
                                <a>Chemocompetent cells transformation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Protocol for chemocompetent cells</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Thermal Shock cell transformation protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#enzymerestriction" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Enzyme restriction
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="enzymerestriction">
 +
                            <li>
 +
                                <a>Protocol for enzyme digestion/alkaline phosphatase treatment
 +
                                    of iGEM plasmids and ligation</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Protocol for enzyme ligation of iGEM parts</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Protocol for enzyme restriction of IDT parts and iGEM plasmid</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#pcr" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            PCR
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="pcr">
 +
                            <li>
 +
                                <a>Protocol for Colony PCR</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Protocol for PCR using VR and VF2 primers</a>
 +
                            </li>
 +
                        </ul>
 +
                    </li>
 +
                    <li>
 +
                        <a href="#plasmidextraction" data-toggle="collapse" aria-expanded="false" data-change="sidemenu">
 +
                            <span class="d-inline-bock open" data-change="el"></span>
 +
                            Plasmid extraction
 +
                        </a>
 +
                        <ul class="collapse list-unstyled" id="plasmidextraction">
 +
                            <li>
 +
                                <a>Agarose Band purification (GenElute - Sigma)</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>Alkaline plasmid purification protocol</a>
 +
                            </li>
 +
                            <li>
 +
                                <a>MiniPrep Sigma extraction protocol</a>
 
                             </li>
 
                             </li>
−
 
 
                         </ul>
 
                         </ul>
 
                     </li>
 
                     </li>
Line 62: Line 222:
 
         </div>
 
         </div>
 
         <div class="container mt-3">
 
         <div class="container mt-3">
−
             <h1>Protocols</h1>
+
             <h1>Protein</h1>
 
             <h2>Chitosan nanoparticles</h2>
 
             <h2>Chitosan nanoparticles</h2>
−
             <div class="row" id="encapsulation">
+
             <div class="row">
 
                 <div class="col">
 
                 <div class="col">
−
                     <h3>Protein encapsulation protocol</h3>
+
                     <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#encapsulation" role="button"
−
                     <div class="mb-3">
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="encapsulation">
−
                         <h4>Reactants</h4>
+
                        <h3>Protein encapsulation protocol</h3>
−
                        <ul>
+
                    </a>
−
                            <li>Chitosan low molecular weight from Sigma-Aldrich</li>
+
                     <div class="collapse" id="encapsulation">
−
                            <li>TPP from Sigma-Aldrich</li>
+
                         <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/0/02/T--TecCEM--Experiments-Proteins2.pdf"
−
                            <li>NaOH 1M</li>
+
                            width="100%" height="900px">
−
                            <li>Acetic acid 1M</li>
+
                         </object>
−
                            <li>Distilled water</li>
+
−
                            <li>Protein of interest (10 mg/mL)</li>
+
−
                         </ul>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
−
                    <h4>Procedure</h4>
+
                </div>
−
                    <div class="mb-3">
+
            </div>
−
                        <em>
+
            <div class="row">
−
                            <h5>Stock solutions</h5>
+
                <div class="col">
−
                         </em>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#encapsulation-efficiency" role="button"
−
                         <ol>
+
                         aria-expanded="false" aria-controls="encapsulation-efficiency">
−
                            <li>In a 15 mL Falcon tube add 30 mg of chitosan and 10 mL of distilled water (to get a
+
                         <h3>Protein encapsulation efficiency protocol</h3>
−
                                solution with a concentration of 3 mg/mL).</li>
+
                    </a>
−
                            <li>Add 10 microliters of acetic acid for each mL of chitosan solution to solubilize the
+
                    <div class="collapse" id="encapsulation-efficiency">
−
                                chitosan.
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/6/62/T--TecCEM--Experiments-Proteins1.pdf"
−
                                To adjust the pH acetic acid and NaOH should be used.</li>
+
                            width="100%" height="900px">
−
                            NOTE: the pH should be adjusted depending on your protein of interest, taking into account
+
                         </object>
−
                            the isoelectric point, always maintaining the chitosan solution positively charged (pH &lt;
+
−
                            6.5)
+
−
                            and the protein of interest negatively charged (preferred).
+
−
                            <li> In another 15 mL falcon
+
−
                                tube add 10 mg of TPP and 10 mL of distilled water (to get a concentration of 1 mg/mL).</li>
+
−
                         </ol>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
−
                    <div class="mb-3">
+
                </div>
−
                        <em>
+
            </div>
−
                            <h5>Nanoparticle preparation</h5>
+
            <div class="row">
−
                         </em>
+
                <div class="col">
−
                         <ol>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#liberation-and-stability" role="button"
−
                            <li>In a 20 mL beaker add 1 mL of chitosan solution and 100 uL of your protein, stir the
+
                         aria-expanded="false" aria-controls="liberation-and-stability">
−
                                mix at 1100 rpm with a magnetic stirrer (the size of nanoparticles is affected by rpm
+
                         <h3>Protein liberation and stability protocol</h3>
−
                                value; for smaller nanoparticles use higher rpm).</li>
+
                    </a>
−
                            <li>Take 1 mL of the TPP solution and add it to the mix dropwise.</li>
+
                    <div class="collapse" id="liberation-and-stability">
−
                            <li>Continue stirring for 1 hour.</li>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/2/23/T--TecCEM--Experiments-Proteins3.pdf"
−
                         </ol>
+
                            width="100%" height="900px">
 +
                         </object>
 
                     </div>
 
                     </div>
−
                    <div class="mb-3">
+
                </div>
−
                        <em>
+
            </div>
−
                            <h5>Particle collection</h5>
+
            <h2>Polyacrylamide gel</h2>
−
                        </em>
+
            <div class="row">
−
                        <ol>
+
                <div class="col">
−
                            <li>Transfer the mix to 2 1.5 mL Eppendorf tubes.</li>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#abpolyacrilamidegel" role="button"
−
                            <em>NOTE: If nanoparticles are to be extracted centrifuge the tubes at 20,000 rpm for 30
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="abpolyacrilamidegel">
−
                                minutes at 4°C.</em>
+
                        <h3>AB Polyacrilamide gel</h3>
−
                            <li>Eliminate the supernatant.</li>
+
                    </a>
−
                            <li>The pellet will contain your protein of interest.</li>
+
                    <div class="collapse" id="abpolyacrilamidegel">
−
                            <li>If nanoparticles are to be used for liberation measurements or suspended in a
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/5/5d/T--TecCEM--Experiments-Proteins4.pdf"
−
                                controlled pH solution, resuspend well and store at 4 °C.</li>
+
                            width="100%" height="900px">
−
                         </ol>
+
                         </object>
 
                     </div>
 
                     </div>
−
                    <div class="mb-3">
+
                </div>
−
                        <em>
+
            </div>
−
                            <h5>TEM preparation</h5>
+
            <div class="row">
−
                        </em>
+
                <div class="col">
−
                        <em>To visualize chitosan nanoparticles some previous preparation steps must be carried out
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#stdpolyacrilamidegeel" role="button"
−
                            (this preparation protocol may vary).</em>
+
                         aria-expanded="false" aria-controls="stdpolyacrilamidegeel">
−
                         <ol>
+
                        <h3>Standard polyacrylamide gel</h3>
−
                            <li>A film of Formvar has to be previously prepared and used to coat a glass slide for the
+
                    </a>
−
                                creation of an 80-120 μm thick membrane.</li>
+
                    <div class="collapse" id="stdpolyacrilamidegeel">
−
                            <li>Place a copper grid on the Formvar membrane for it to be absorbed and later removed
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/2/2c/T--TecCEM--Experiments-Proteins5.pdf"
−
                                with a needle.</li>
+
                             width="100%" height="900px">
−
                            <li>Add 20 μL of your solution of interest into the grid and let it be absorbed. Add a
+
                         </object>
−
                                solution of 1% (w/v) phosphotungstic acid until the sample dries.</li>
+
−
                            <li>View in a transmission electron microscope.</li>
+
−
                             <em>NOTE: Samples were observed at 150,000x.</em>
+
−
                         </ol>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
−
             <div class="row" id="encapsulation-efficiency">
+
            <h2>Production/purification</h2>
 +
             <div class="row">
 
                 <div class="col">
 
                 <div class="col">
−
                     <h3>Protein encapsulation efficiency protocol</h3>
+
                     <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#criofracture" role="button"
 +
                        aria-expanded="false" aria-controls="criofracture">
 +
                        <h3>Criofracture</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="criofracture">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/79/T--TecCEM--Experiments-Proteins6.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
−
             <div class="row" id="liberation-and-stability">
+
             <div class="row">
 
                 <div class="col">
 
                 <div class="col">
−
This protocol will evaluate and standardize encapsulation efficiency when working with a specific protein. It is highly recommended to work with a highly purified protein sample, so as to get the most reliable quantification. Measurements are performed according to the Bradford assay.
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#fluorescentproteinproduction" role="button"
−
<p><em>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="fluorescentproteinproduction">
−
Detection range: 0.1-1.4 mg/mL</p></em>
+
                        <h3>Fluorescent protein production</h3>
−
<p>NOTE: Bradford reactant must be at room temperature and shaken gently before starting the protocol.
+
                    </a>
−
</p>
+
                    <div class="collapse" id="fluorescentproteinproduction">
−
<em>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/74/T--TecCEM--Experiments-Proteins7.pdf"
−
                            <h5>Calibration curve of BSA</h5></em>
+
                            width="100%" height="900px">
−
 
+
                        </object>
−
<ul>
+
                    </div>
−
BSA Stock solution</ul>
+
                </div>
−
<ol>
+
            </div>
−
<li>Prepare 10 mg/mL BSA solution</li>
+
            <div class="row">
−
<li>Store in ice for further use</li></ol>
+
                <div class="col">
−
 
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#proteinproductionpurificationprotocol"
−
<ul>Dilutions</ul>
+
                        role="button" aria-expanded="false" aria-controls="proteinproductionpurificationprotocol">
−
<p></p>
+
                        <h3>Protein production/purification
−
Loaded and empty nanoparticles are prepared under the same conditions (agitation, temperature, pH, and reactant concentrations). Thus, we used a sample of empty encapsulation supernatant as a blank to construct a standard curve to estimate protein encapsulation efficiency. Volumes of supernatant were mixed with volumes of BSA stock solution to obtain dilutions of known protein concentrations.
+
                            protocol</h3>
−
<p></p>
+
                    </a>
−
<ol>
+
                    <div class="collapse" id="proteinproductionpurificationprotocol">
−
<li>Refer to encapsulation protocol to prepare empty chitosan nanoparticles.</li>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/e/e9/T--TecCEM--Experiments-Proteins8.pdf"
−
<li>Prepare encapsulation solution aliquots.</li>
+
                            width="100%" height="900px">
−
<li>Centrifuge samples after splitting the initial encapsulation volume at 13,400 rpm for 30 min.</li>
+
                        </object>
−
<li>Supernatant will be used to derive the curve. Do not discard.</li></ol>
+
                    </div>
−
<p></p>
+
                </div>
−
<em>Prepare dilutions according to the following table and label each tube. A small-scale procedure was adapted from Sigma Aldrich to perform Bradford assay on the prepared dilutions.</em>
+
            </div>
−
<p></p>
+
            <h2>Proteic quantification</h2>
−
<em>
+
            <div class="row">
−
<b>Table 1.</b> Dilutions to derive a standard curve for encapsulation efficiency quantification
+
                <div class="col">
−
</em>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#bradford" role="button"
−
<table>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="bradford">
−
<thead>
+
                        <h3>Bradford</h3>
−
<tr>
+
                    </a>
−
<th>
+
                    <div class="collapse" id="bradford">
−
Dilution
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/f/f9/T--TecCEM--Experiments-Proteins9.pdf"
−
</th>
+
                            width="100%" height="900px">
−
<th>
+
                        </object>
−
BSA concentration (mg/mL)
+
                    </div>
−
</th>
+
                </div>
−
<th>
+
            </div>
−
Volume of BSA stock solution 10 mg/mL (uL)
+
            <div class="row">
−
</th>
+
                <div class="col">
−
<th>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#lowry" role="button" aria-expanded="false"
−
Volume of empty nanoparticle encapsulation supernatant (uL)
+
                        aria-controls="lowry">
−
</th>
+
                        <h3>Lowry</h3>
−
<th>
+
                    </a>
−
Final volume (uL)
+
                    <div class="collapse" id="lowry">
−
</th>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/9/90/T--TecCEM--Experiments-Proteins10.pdf"
−
</tr>
+
                            width="100%" height="900px">
−
</thead>
+
                        </object>
−
<tbody>
+
                    </div>
−
<tr>
+
                </div>
−
<td>
+
            </div>
−
0
+
            <div class="row">
−
</td>
+
                <div class="col">
−
<td>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#piercebca" role="button"
−
0
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="piercebca">
−
</td>
+
                        <h3>Pierce BCA</h3>
−
<td>
+
                    </a>
−
0
+
                    <div class="collapse" id="piercebca">
−
</td>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/a/af/T--TecCEM--Experiments-Proteins11.pdf"
−
<td>
+
                            width="100%" height="900px">
−
100
+
                        </object>
−
</td>
+
                    </div>
−
<td>
+
                </div>
−
100
+
            </div>
−
</td>
+
        </div>
−
</tr>
+
        <div class="container mt-3">
−
<tr>
+
            <h1>Cells</h1>
−
<td>
+
            <div class="row">
−
1
+
                <div class="col">
−
</td>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#cellessay" role="button"
−
<td>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="cellessay">
−
0.26
+
                        <h3>In vitro burn essay protocol</h3>
−
</td>
+
                    </a>
−
<td>
+
                    <div class="collapse" id="cellessay">
−
2.6
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/6/66/T--TecCEM--Experiments-Cells.pdf"
−
</td>
+
                            width="100%" height="900px">
−
<td>
+
                        </object>
−
97.4
+
                    </div>
−
</td>
+
                </div>
−
<td>
+
            </div>
−
100
+
        </div>
−
</td>
+
        <div class="container mt-3">
−
</tr>
+
            <h1>Reactants</h1>
−
<tr>
+
            <div class="row">
−
<td>
+
                <div class="col">
−
2
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#creationlysisbbuffer" role="button"
−
</td>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="creationlysisbbuffer">
−
<td>
+
                        <h3>Protocol for the creation of lysis buffer P</h3>
−
0.52
+
                    </a>
−
</td>
+
                    <div class="collapse" id="creationlysisbbuffer">
−
<td>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/e/e9/T--TecCEM--Experiments-Reactants1.pdf"
−
5.2
+
                            width="100%" height="900px">
−
</td>
+
                        </object>
−
<td>
+
                    </div>
−
94.8
+
                </div>
−
</td>
+
            </div>
−
<td>
+
            <div class="row">
−
100
+
                <div class="col">
−
</td>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#creationpolyacrylamidegel" role="button"
−
</tr>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="creationpolyacrylamidegel">
−
<tr>
+
                        <h3>Protocol for the creation of polyacrylamide gel</h3>
−
<td>
+
                    </a>
−
3
+
                    <div class="collapse" id="creationpolyacrylamidegel">
−
</td>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/c/c1/T--TecCEM--Experiments-Reactants2.pdf"
−
<td>
+
                            width="100%" height="900px">
−
0.78
+
                        </object>
−
</td>
+
                    </div>
−
<td>
+
                </div>
−
7.8
+
            </div>
−
</td>
+
            <div class="row">
−
<td>
+
                <div class="col">
−
92.2
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#creationthemlysisbuffer" role="button"
−
</td>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="creationthemlysisbuffer">
−
<td>
+
                        <h3>Protocol for the creation of thermal lysis buffer</h3>
−
100
+
                    </a>
−
</td>
+
                    <div class="collapse" id="creationthemlysisbuffer">
−
</tr>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/2/21/T--TecCEM--Experiments-Reactants3.pdf"
−
<tr>
+
                            width="
−
<td>
+
                            100%" height="900px">
−
4
+
                        </object>
−
</td>
+
                    </div>
−
<td>
+
                </div>
−
1.04
+
            </div>
−
</td>
+
            <div class="row">
−
<td>
+
                <div class="col">
−
10.4
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#creationpolyacrylamideab" role="button"
−
</td>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="creationpolyacrylamideab">
−
<td>
+
                        <h3>Protocol to make polyacrylamide AB</h3>
−
89.6
+
                    </a>
−
</td>
+
                    <div class="collapse" id="creationpolyacrylamideab">
−
<td>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/19/T--TecCEM--Experiments-Reactants4.pdf"
−
100
+
                            width="100%" height="900px">
−
</td>
+
                        </object>
−
</tr>
+
                    </div>
−
<tr>
+
                </div>
−
<td>
+
            </div>
−
5
+
        </div>
−
</td>
+
        <div class="container mt-3">
−
<td>
+
            <h1>Nucleic acids</h1>
−
1.4
+
            <h2>Cell transformation</h2>
−
</td>
+
            <div class="row">
−
<td>
+
                <div class="col">
−
14
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#chemocompetentcells" role="button"
−
</td>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="chemocompetentcells">
−
<td>
+
                        <h3>Chemocompetent cells transformation protocol</h3>
−
86
+
                    </a>
−
</td>
+
                    <div class="collapse" id="chemocompetentcells">
−
<td>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/f/fe/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids1.pdf"
−
100
+
                            width="100%" height="900px">
−
</td>
+
                        </object>
−
</tr>
+
                    </div>
−
</tbody>
+
                </div>
−
</table>
+
            </div>
−
<ul>
+
            <div class="row">
−
Experimental procedure</ul>
+
                <div class="col">
−
<p></p>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#pcc" role="button" aria-expanded="false"
−
<ol>
+
                        aria-controls="pcc">
−
<li>Place 6.5 μL of each pattern of BSA (0 mg/mL to 1.4 mg/mL) in sterile 0.6 mL tubes.</li>
+
                        <h3>Protocol for chemocompetent cells</h3>
−
<li>Add 193.5 μL of Bradford reagent to each tube. The final volume is 200 μL.</li>
+
                    </a>
−
<li>Vortex gently.</li>
+
                    <div class="collapse" id="pcc">
−
<li>Incubate 5-45 min at room temperature (until a change in color is noticeable).</li>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/77/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids2.pdf"
−
<li>Transfer 50 μL to a spectrophotometer cell.</li>
+
                            width="100%" height="900px">
−
<li>Blank with the tube of null BSA concentration + Bradford reagent.</li>
+
                        </object>
−
<li>Take absorbance at 595 nm for the samples and record it.</li>
+
                    </div>
−
<li>Derive a standard curve for protein concentration in encapsulation supernatant.</li>
+
                </div>
−
</ol><p></p>
+
            </div>
−
Note: There shouldn’t be a time difference higher than 10 minutes between each read.
+
            <div class="row">
−
<p></p>
+
                <div class="col">
−
<em>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#tsc" role="button" aria-expanded="false"
−
<h5>Efficiency quantification</h5></em>
+
                        aria-controls="tsc">
−
<p></p>
+
                        <h3>Thermal Shock cell transformation protocol</h3>
−
Refer to protein encapsulation protocol here using BSA.
+
                    </a>
−
NOTE: Calculate initial protein concentration before stirring and record it.
+
                    <div class="collapse" id="tsc">
−
<p></p>
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/5/58/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids3.pdf"
−
<ul>
+
                            width="
−
Experimental procedure</ul>
+
                            100%" height="900px">
−
<p></p>
+
                        </object>
−
<ol>
+
                    </div>
−
<li>Prepare eight 1 mL aliquots of loaded chitosan nanoparticles: four empty, four containing the protein of interest.</li>
+
                </div>
−
<li>Centrifuge aliquots at 13,400 rpm for 30 min.</li>
+
            </div>
−
<li>Take 6.5 μL of the supernatant and measure absorbance at 595 nm with 193.5 μL of Bradford reagent. Remember to incubate this mix at room temperature 5-45 minutes (until a change of color is noticeable).</li>
+
            <h2>Enzyme restriction</h2>
−
<li>Record reads and estimate protein concentration in the supernatant using the previously derived standard curve.</li>
+
            <div class="row">
−
<li>Calculate encapsulation efficiency at this initial time as follows.</li>
+
                <div class="col">
−
</ol>
+
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#ligacion" role="button"
−
<p></p>
+
                        aria-expanded="false" aria-controls="ligacion">
−
<div class="text-center">
+
                        <h3>Protocol for enzyme digestion/alkaline phosphatase treatment of iGEM plasmids and ligation</h3>
−
                                <figure class="figure text-left">
+
                    </a>
−
                                    <img style="max-height: 70vh;" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/9/99/T--TecCEM--Figure5Improvement.png"
+
                    <div class="collapse" id="ligacion">
−
                                        class="figure-img img-fluid rounded" alt="IMP-1">
+
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/3/39/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids4.pdf"
−
                           
+
                            width="100%" height="900px">
−
                                </figure>
+
                        </object>
−
                            </div>
+
                    </div>
−
 
+
                </div>
−
                     <h3>Protein liberation and stability protocol</h3>
+
            </div>
 +
            <div class="row">
 +
                <div class="col">
 +
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#enzymelig" role="button"
 +
                        aria-expanded="false" aria-controls="enzymelig">
 +
                        <h3>Protocol for enzyme ligation of iGEM parts</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="enzymelig">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/b/bd/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids5.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 +
                </div>
 +
            </div>
 +
            <div class="row">
 +
                <div class="col">
 +
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#enzres" role="button" aria-expanded="false"
 +
                        aria-controls="enzres">
 +
                        <h3>Protocol for enzyme restriction of IDT parts and iGEM plasmid</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="enzres">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/8/84/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids6.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 +
                </div>
 +
            </div>
 +
            <h2>PCR</h2>
 +
            <div class="row">
 +
                <div class="col">
 +
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#protocolforcolonypcr" role="button"
 +
                        aria-expanded="false" aria-controls="protocolforcolonypcr">
 +
                        <h3>Protocol for Colony PCR</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="protocolforcolonypcr">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/e/eb/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids7.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 +
                </div>
 +
            </div>
 +
            <div class="row">
 +
                <div class="col">
 +
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#protocolforpcrvrvf2primers" role="button"
 +
                        aria-expanded="false" aria-controls="protocolforpcrvrvf2primers">
 +
                        <h3>Protocol for PCR using VR and VF2 primers</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="protocolforpcrvrvf2primers">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/3/3c/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids8.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 +
                </div>
 +
            </div>
 +
            <h2>Plasmid extraction</h2>
 +
            <div class="row">
 +
                <div class="col">
 +
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#agarosebandpurification" role="button"
 +
                        aria-expanded="false" aria-controls="agarosebandpurification">
 +
                        <h3>Agarose Band purification (GenElute - Sigma)</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="agarosebandpurification">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/4/44/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids9.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 +
                </div>
 +
            </div>
 +
            <div class="row">
 +
                <div class="col">
 +
                    <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#alkalineplasmidpurification" role="button"
 +
                        aria-expanded="false" aria-controls="alkalineplasmidpurification">
 +
                        <h3>Alkaline plasmid purification protocol</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="alkalineplasmidpurification">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/e/e4/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids10.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 +
                </div>
 +
            </div>
 +
            <div class="row">
 +
                <div class="col">
 +
                     <a class="btn-link text-notebook" data-toggle="collapse" href="#miniprepsigma" role="button"
 +
                        aria-expanded="false" aria-controls="miniprepsigma">
 +
                        <h3>MiniPrep Sigma extraction protocol</h3>
 +
                    </a>
 +
                    <div class="collapse" id="miniprepsigma">
 +
                        <object type="application/pdf" data="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/17/T--TecCEM--Experiments-NucleicAcids11.pdf"
 +
                            width="100%" height="900px">
 +
                        </object>
 +
                    </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>

Latest revision as of 23:43, 17 October 2018

Cell Gif

Experiments

This is our experiment section. Here we compile important protocols for the development of TecTissue, ranging from our bacterial transformation procedures to our cell proliferation assays. We also address cell culture maintenance and protein loaded chitosan nanoparticles. Here you may find the protocol for our growth factor delivery to damaged cells and how much harm can be inflicted in vitro.

Protein

Chitosan nanoparticles

Polyacrylamide gel

Production/purification

Proteic quantification

Cells

Reactants

Nucleic acids

Cell transformation

Enzyme restriction

PCR

Plasmid extraction