Difference between revisions of "Team:HZAU-China/Experiments"

 
(24 intermediate revisions by 6 users not shown)
Line 91: Line 91:
 
             z-index: 1;
 
             z-index: 1;
 
             background-color: #EEEEEE;
 
             background-color: #EEEEEE;
−
            opacity: 0.96;
 
−
            filter: alpha(opacity=96);
 
 
             box-shadow: 0 5px 15px #CCCCCC;
 
             box-shadow: 0 5px 15px #CCCCCC;
 
             display: none;
 
             display: none;
Line 154: Line 152:
 
         }
 
         }
  
−
         .daohang a:hover span{
+
         .daohang a:hover span {
−
             transform: rotateY(180deg);          
+
             transform: rotateY(180deg);
−
             -webkit-transform: rotateY(180deg);          
+
             -webkit-transform: rotateY(180deg);
−
             -moz-transform: rotateY(180deg);          
+
             -moz-transform: rotateY(180deg);
−
             -o-transform: rotateY(180deg);          
+
             -o-transform: rotateY(180deg);
 
             -ms-transform: rotateY(180deg);
 
             -ms-transform: rotateY(180deg);
−
             transition: all 0.5s ease-in-out;          
+
             transition: all 0.5s ease-in-out;
−
             -webkit-transition: all 0.5s ease-in-out;          
+
             -webkit-transition: all 0.5s ease-in-out;
−
             -moz-transition: all 0.5s ease-in-out;          
+
             -moz-transition: all 0.5s ease-in-out;
 
             -o-transition: all 0.5s ease-in-out;
 
             -o-transition: all 0.5s ease-in-out;
 
         }
 
         }
Line 244: Line 242:
  
 
             .daohangyi {
 
             .daohangyi {
−
                 font-size: 14px;
+
                 font-size: 12px;
 
             }
 
             }
 
         }
 
         }
  
−
         @media screen and (max-width: 880px) {
+
         @media screen and (max-width: 900px) {
  
 
             .daohang .caidan {
 
             .daohang .caidan {
Line 269: Line 267:
 
             .daohangyi img {
 
             .daohangyi img {
 
                 display: none;
 
                 display: none;
 +
            }
 +
 +
            .daohang .longName .item:before {
 +
                width: 150px;
 +
                left: 20px;
 +
            }
 +
 +
            .daohang .longName .item:hover:after {
 +
                width: 150px;
 +
                left: 20px;
 
             }
 
             }
 
         }
 
         }
Line 292: Line 300:
 
             width: 80%;
 
             width: 80%;
 
             /* height: auto; */
 
             /* height: auto; */
−
             margin: 20px 20px 0 0;
+
             margin: 20px 40px 0 0;
 
             /* right: 2%; */
 
             /* right: 2%; */
 
             /* top: 90px; */
 
             /* top: 90px; */
−
             padding: 20px 3%;
+
             padding: 50px 3%;
 
             float: right;
 
             float: right;
 
             /* position: relative; */
 
             /* position: relative; */
Line 308: Line 316:
  
 
         .cebian {
 
         .cebian {
−
             width: 15%;
+
             width: 200px;
 
             /* height: 80vh; */
 
             /* height: 80vh; */
 
             float: left;
 
             float: left;
Line 317: Line 325:
 
             /* border:2px solid black */
 
             /* border:2px solid black */
 
             /* background-color: #323643 */
 
             /* background-color: #323643 */
 +
        }
 +
 +
        .zhengwen p{
 +
            text-align: justify !important;
 +
            font-family:  'Times New Roman',Helvetica,'Open Sans',  Arial, sans-serif !important;
 +
            color: #3B3B3B;
 +
            font-size: 26px !important;
 +
            padding-right: 20px;
 
         }
 
         }
  
Line 327: Line 343:
  
 
         .h1 {
 
         .h1 {
−
            height: 100px;
+
             line-height: 55px;
−
             line-height: 100px;
+
 
             font-weight: bold;
 
             font-weight: bold;
 +
            height:auto;
 
             font-family: 'Product Sans', sans-serif;
 
             font-family: 'Product Sans', sans-serif;
−
             font-size: 50px;
+
             font-size: 40px;
−
             color: black;
+
             color: #3B3B3B;
−
             border-bottom: 3px solid black;
+
             border-bottom: 2px solid #676767;
−
             /* margin: 0 2.4%; */
+
            margin-bottom: 20px;
 +
        }
 +
 
 +
        .h2 {
 +
            height: 40px;
 +
            line-height: 40px;
 +
            font-weight: bold;
 +
            height:auto;
 +
            /* font-weight: bold; */
 +
            font-family: 'Product Sans', sans-serif;
 +
            font-size: 30px;
 +
            color: #484848;
 +
             /* margin-bottom: 20px; */
 +
        }
 +
 
 +
        .h3 {
 +
            height: 30px;
 +
            line-height: 30px;
 +
            font-weight: bold;
 +
            height:auto;
 +
            /* font-weight: bold; */
 +
            font-family: 'Product Sans', sans-serif;
 +
            font-size: 24px;
 +
            color: #484848;
 +
            /* margin-bottom: 20px; */
 +
        }
 +
       
 +
        table {
 +
            color: #3B3B3B;
 
         }
 
         }
  
Line 452: Line 496:
  
 
         #float02 {}
 
         #float02 {}
−
 
−
        #float03 {}
 
  
 
         div.floatCtro {
 
         div.floatCtro {
 
             width: 100%;
 
             width: 100%;
−
             height: 250px;
+
             /* height: auto; */
 
             margin: 0;
 
             margin: 0;
 
             position: relative;
 
             position: relative;
Line 467: Line 509:
 
             display: block;
 
             display: block;
 
             width: 100%;
 
             width: 100%;
−
             height: 40px;
+
             /* height: auto; */
 +
            /* text-align: left !important; */
 
             color: #ffffff !important;
 
             color: #ffffff !important;
 
             font-size: 16px;
 
             font-size: 16px;
 +
            padding:0;
 
             background-color: #323643;
 
             background-color: #323643;
 
             border-bottom: 1px solid black;
 
             border-bottom: 1px solid black;
−
             /* border-radius: 5px; */
+
             padding:0 3%;
 
             text-decoration: none !important;
 
             text-decoration: none !important;
 
         }
 
         }
Line 478: Line 522:
 
         div.floatCtro .daohanger {
 
         div.floatCtro .daohanger {
 
             width: 100%;
 
             width: 100%;
−
             text-align: justify !important;
+
             text-align: left !important;
−
             height: 45px;
+
             height: auto;
−
             line-height: 45px;
+
             line-height: 25px;
 
             font-family: Arial;
 
             font-family: Arial;
−
             font-size: 14px;
+
             font-size: 14px !important;
 
             color: #676767;
 
             color: #676767;
 
             margin: 0;
 
             margin: 0;
−
             padding-left: 8%;
+
             padding:10px 8%;
 
             cursor: pointer;
 
             cursor: pointer;
 
             background: #fff;
 
             background: #fff;
Line 495: Line 539:
 
             width: 100%;
 
             width: 100%;
 
             height: 40px;
 
             height: 40px;
 +
            padding:10px 8%;
 
             /* margin: 10px 0 0 0; */
 
             /* margin: 10px 0 0 0; */
 
             background: #FFF;
 
             background: #FFF;
Line 504: Line 549:
 
         div.floatCtro a span {
 
         div.floatCtro a span {
 
             display: block;
 
             display: block;
−
             height: 44px;
+
             height: auto;
−
             line-height: 44px;
+
            text-align: left !important;
 +
             line-height: 18px;
 
             font-family: Arial;
 
             font-family: Arial;
 
             font-size: 16px;
 
             font-size: 16px;
−
            padding-left: 8%;
 
 
         }
 
         }
  
Line 533: Line 578:
  
 
         .biaoti {
 
         .biaoti {
−
             line-height: 40px;
+
             display: inline-block;
−
             width: 50%;
+
            margin: 8px 0;
−
             margin-left: 6%;
+
             /* width: 50%; */
−
             text-align: center;
+
             /* margin-left: 6%; */
 +
             /* text-align: center; */
 
             text-decoration: none !important;
 
             text-decoration: none !important;
 
         }
 
         }
Line 571: Line 617:
 
         }
 
         }
  
−
         @media screen and (max-width: 1000px) {             
+
         @media screen and (max-width: 1200px) {             
 
            
 
            
 +
            .cebian {
 +
            width: 15%;
 +
            }
 +
 +
            .zhengwen {
 +
            margin: 20px 20px 0 0;
 +
 
             .daohangyi {
 
             .daohangyi {
 
                 font-size: 14px;
 
                 font-size: 14px;
 
             }
 
             }
 +
            .daohangyi img {
 +
                display: none;
 +
            } 
 
         }
 
         }
  
−
         @media screen and (max-width: 880px) {
+
         @media screen and (max-width: 900px) {
  
 
             .daohangyi img {
 
             .daohangyi img {
Line 616: Line 672:
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Experiments">Experiments</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Experiments">Experiments</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Improve">Improve</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Improve">Improve</a>
−
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/InterLab">Interlab</a>
+
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/InterLab">InterLab</a>
 +
                <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Notebook">Notebook</a>
 +
 
 
             </li>
 
             </li>
 
             <li class="hiLight shortName">
 
             <li class="hiLight shortName">
Line 631: Line 689:
 
                     <span class="xjtPic"></span>
 
                     <span class="xjtPic"></span>
 
                 </a>
 
                 </a>
−
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Safety">Safty</a>
+
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Safety">Safety</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Human_Practices">Human Practices</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Human_Practices">Human Practices</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Public_Engagement">Public Engagement</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Public_Engagement">Public Engagement</a>
Line 644: Line 702:
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Collaborations">Collaborations</a>
 
                 <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Collaborations">Collaborations</a>
 
             </li>
 
             </li>
−
             <li class="shortName">
+
             <li class="hiLight shortName">
−
                 <a class="nav_head" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Parts">
+
                 <a class="nav_head" href="#">
 
                     <span>Parts</span>
 
                     <span>Parts</span>
 +
                    <span class="xjtPic"></span>
 
                 </a>
 
                 </a>
 +
                <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Basic_Part">Basic</a>
 +
                <a class="item" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Composite_Part">Composite</a>
 
             </li>
 
             </li>
 
         </ul>
 
         </ul>
Line 656: Line 717:
 
         <!-- 正文 -->
 
         <!-- 正文 -->
 
         <div class="zhengwen">
 
         <div class="zhengwen">
−
            <img class="daimg" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/70/T--HZAU-China--hezhao1.png" alt="">
 
 
             <div id="float01" class="cur">
 
             <div id="float01" class="cur">
−
                 <div class="h1">biaotiyi</div>
+
                 <div class="h1">Material</div>
  
 +
                <div class="h2"><b>1. </b>Bacteria Strains used in this work</div>
 +
                <table class="table table-bordered table-hover">
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Strain</th>
 +
                            <th>Description</th>
 +
                            <th>Usage</th>
 +
                            <th>Sourse</th>
 +
                        </tr>
 +
                    </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                        <tr>
 +
                            <td><i>E.coli</i> trans-5α</td>
 +
                            <td class="success">Basic strain of calcium conversion</td>
 +
                            <td class="success">Plasmid construction, molecular cloning</td>
 +
                            <td class="success">Purchase by Shanghai Weidi Biotechnology</td>
 +
                        </tr>
 +
                        <tr>
 +
                            <td><i>E.coli</i> MG1655</td>
 +
                            <td class="success">Type strain</td>
 +
                            <td class="success">Phenotypic validation</td>
 +
                            <td class="success">Provide by Dr. Chenli Liu (SIAT CSynBER) </td>
 +
                        </tr>
 +
                        <tr>
 +
                            <td><i>S.</i> typhimurium SL1344</td>
 +
                            <td class="success">Type strain</td>
 +
                            <td class="success">Phenotypic validation</td>
 +
                            <td class="success">Provide by Dr. Shan Li (Bio-Medical Center of HZAU)</td>
 +
                        </tr>
 +
                        <tr>
 +
                            <td><i>S.</i> typhimurium SL1344 (<i>ΔsifA</i>）</td>
 +
                            <td class="success">Decrease toxicity and infectivity</td>
 +
                            <td class="success">Phenotypic validation</td>
 +
                            <td class="success">This work</td>
 +
                        </tr>
 +
                        <tr>
 +
                            <td><i>S.</i> typhimurium SL1344 (<i>ΔsipD</i>）</td>
 +
                            <td class="success">Knockout Type III secretion system</td>
 +
                            <td class="success">Phenotypic validation</td>
 +
                            <td class="success">This work</td>
 +
                        </tr>
 +
 +
                    </tbody>
 +
                </table>
 +
 +
           
 +
 +
           
 +
                <div class="h2"><b>2. </b>Culture Condition</div>
 +
                <table class="table table-bordered table-hover">
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <td>Culture medium</td>
 +
                            <td>Compositions</td>
 +
                        </tr>
 +
 +
                    </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                        <tr>
 +
                            <td>Luria Broth (LB)</td>
 +
                            <td>0.5% yeast extraction,1% NaCl and 1% tryptone (add 15 g/L agar when prepare solid
 +
                                culture)</td>
 +
 +
                        </tr>
 +
                        <tr>
 +
                            <td>Super Optimal Broth (SOB)</td>
 +
                            <td>0.5% yeast extraction, 0.05% NaCl and 2% tryptone (add 15 g/L agar when prepare solid
 +
                                culture) (add 5ml 2 mol/L MgCl<sub>2</sub> before use)</td>
 +
                        </tr>
 +
                    </tbody>
 +
                </table>
 
             </div>
 
             </div>
 +
 +
 +
 +
 
             <div id="float02">
 
             <div id="float02">
−
                 <div class="h1">biaotier</div>
+
                 <div class="h1">Method</div>
 +
                <div class="h2"><b>1. </b>Plasmid construction</div>
 +
                <p>Our fragments was PCR amplified with KOD (TOYOBO<sup>®</sup>) or PrimeSTAR (Takara<sup>®</sup>)
 +
                    according to product length. <br><br>
 +
                    Product is recycled with gel extraction kit from OMEGA<sup>®</sup> after electrophoresis. <br><br>
 +
                    ClonExpress<sup>®</sup> II One Step Cloning Kit (Vyzyme) was used to ligate every fragment to
 +
                    construct the most plasmids. <br><br>
 +
                    All plasmid constructs were confirmed by sequencing at Sangon<sup>®</sup>, Inc. (Wuhan,China).<br><br>
 +
                    A single frozen glycerol stock was used throughout this study for each bacterial strain.<br><br>
 +
                </p>
  
 +
                <div class="h2"><b>2. </b>Transformation</div>
 +
                <p>
 +
                    1. Add 3-5μl plasmid to 50μl F-trans5α (Weidi Biotechnology) competent cells and incubate 5min in ice
 +
                    , coated plates, select monoclonal colony PCR. Add extra 42℃ heat shock 45s and incubate 10min step
 +
                    will increase transformation efficiency.
 +
                    Or 1.5kv, 4-5ms electroporate cell with 300-400 ng purified plasmid. Recover at 37°C 950 rpm for 1h.
 +
                    <br><br>
 +
                    2. Plated on LB agar plates containing appropriate concentration of antibody for selection, grown
 +
                    overnight at 37°C. And prepare PCR reaction to select individual bacterial colony.
 +
                </p>
 +
                <div class="h2"><b>3. </b>Fluorescence/growth measurememt</div>
 +
                <p>
 +
                    Cell are cultured overnight in LB broth containing corresponding antibiotics, and diluted to OD is
 +
                    0.1 with fresh LB broth.<br><br>
 +
                    Expression was induced at early log phase by addition of different ATc (150 ng/ml–15μg/ml)
 +
                    concentrations. Culture the plate in 37℃, 150 rpm. Every hour put it into a plate reader to
 +
                    measure its fluorescence/OD<sup>1</sup>.
 +
                </p>
 
             </div>
 
             </div>
 +
 
             <div id="float03">
 
             <div id="float03">
−
                 <div class="h1">biaotisan</div>
+
                 <div class="h1">Modeling impact our experiment</div>
−
                  
+
                 <p>The higher ATc level might thwart bacterial growth. So we need to analyze a proper concentration of
 +
                    ATc, We design a modeling to predict a suitable concentration of ATc (More result about our model
 +
                    please check <a href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Model">modeling: Chemical control model</a>).
 +
                    We induced our engineered strain with gradients of ATc. Take 100μl culture to plate on LB agar
 +
                    plates containing appropriate concentration of antibody after 5 minutes, 30 minutes, 90 minutes of
 +
                    induce and counting Colony Forming Units the next day. The results fit the model within a range of
 +
                    ATc. So we choose a appropriate concentration of ATc (16μg/ml), aiming to maximize the expression of
 +
                    GSDMD-N275 and minimize the negative effect of bacteria growth.
 +
                </p>
 +
                <div class="h1">Reference</div>
 +
                <p>1. Becskel, A. & Serrano, L. Engineering stability in gene networks by autoregulation. Nature 405,
 +
                    590–593 (2000).</p>
 
             </div>
 
             </div>
 
         </div>
 
         </div>
−
        <!-- 侧边 -->
+
    </div>
−
        <div class="cebian">
+
 
−
            <!-- 滚动菜单栏 -->
+
    <!-- 侧边 -->
−
            <div class="daohangyi">
+
    <div class="cebian">
−
                    <span class="biaoti">Experiments</span>
+
        <!-- 滚动菜单栏 -->
−
                    <span class="xsjPic"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/8/8d/T--HZAU-China--xjt.svg" alt=""></span>
+
        <div class="daohangyi">
−
            </div>
+
                <span class="biaoti">Experiments</span>
−
            <div class="floatCtro">
+
                <span class="xsjPic"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/8/8d/T--HZAU-China--xjt.svg" alt=""></span>
−
                <p class="daohanger">neirongyi</p>
+
        </div>
−
                <p class="daohanger">neironger</p>
+
        <div class="floatCtro">
−
                <p class="daohanger">neirongsan</p>
+
            <p class="daohanger">Material</p>
−
                <a>
+
            <p class="daohanger">Method</p>
−
                    <span>Back&nbsp;to&nbsp;Top</span>
+
            <p class="daohanger">Modeling impact our experiment</p>
−
                </a>
+
            <a>
−
            </div>
+
                <span>Back&nbsp;to&nbsp;Top</span>
−
            <a class="daohangyi" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Improve">
+
−
                <span class="biaoti">Improve</span>
+
−
                <span class="xsjPic"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/7c/T--HZAU-China--ysj.svg" alt=""></span>
+
−
            </a>
+
−
            <a class="daohangyi" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Interlab">
+
−
                <span class="biaoti">Interlab</span>
+
−
                <span class="xsjPic"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/7c/T--HZAU-China--ysj.svg" alt=""></span>
+
 
             </a>
 
             </a>
−
            <!-- 滚动菜单栏 -->
 
 
         </div>
 
         </div>
 +
        <a class="daohangyi" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Improve">
 +
            <span class="biaoti">Improve</span>
 +
            <span class="xsjPic"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/7c/T--HZAU-China--ysj.svg" alt=""></span>
 +
        </a>
 +
        <a class="daohangyi" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/InterLab">
 +
            <span class="biaoti">InterLab</span>
 +
            <span class="xsjPic"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/7c/T--HZAU-China--ysj.svg" alt=""></span>
 +
        </a>
 +
        <a class="daohangyi" href="https://2018.igem.org/Team:HZAU-China/Notebook">
 +
            <span class="biaoti">Notebook</span>
 +
            <span class="xsjPic"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/7c/T--HZAU-China--ysj.svg" alt=""></span>
 +
        </a>
 +
        <!-- 滚动菜单栏 -->
 +
    </div>
 
     </div>
 
     </div>
  
Line 716: Line 896:
 
             scrolls()
 
             scrolls()
 
             function scrolls() {
 
             function scrolls() {
−
                 var f1, f2, f3, bck;
+
                 var f1, f2, bck;
 
                 var fixRight = $('div.floatCtro p');
 
                 var fixRight = $('div.floatCtro p');
 
                 var blackTop = $('div.floatCtro a')
 
                 var blackTop = $('div.floatCtro a')
Line 722: Line 902:
 
                 fl = $('#float01').offset().top;
 
                 fl = $('#float01').offset().top;
 
                 f2 = $('#float02').offset().top;
 
                 f2 = $('#float02').offset().top;
−
                f3 = $('#float03').offset().top;
 
  
 
                 if (sTop <= f2 - 100) {
 
                 if (sTop <= f2 - 100) {
Line 736: Line 915:
 
                 if (sTop >= f2 - 100) {
 
                 if (sTop >= f2 - 100) {
 
                     fixRight.eq(1).addClass('cur').siblings().removeClass('cur');
 
                     fixRight.eq(1).addClass('cur').siblings().removeClass('cur');
−
                }
 
−
                if (sTop >= f3 - 100) {
 
−
                    fixRight.eq(2).addClass('cur').siblings().removeClass('cur');
 
 
                 }
 
                 }
  

Latest revision as of 03:57, 18 October 2018

Material
1. Bacteria Strains used in this work
Strain Description Usage Sourse
E.coli trans-5α Basic strain of calcium conversion Plasmid construction, molecular cloning Purchase by Shanghai Weidi Biotechnology
E.coli MG1655 Type strain Phenotypic validation Provide by Dr. Chenli Liu (SIAT CSynBER)
S. typhimurium SL1344 Type strain Phenotypic validation Provide by Dr. Shan Li (Bio-Medical Center of HZAU)
S. typhimurium SL1344 (ΔsifA） Decrease toxicity and infectivity Phenotypic validation This work
S. typhimurium SL1344 (ΔsipD） Knockout Type III secretion system Phenotypic validation This work
2. Culture Condition
Culture medium Compositions
Luria Broth (LB) 0.5% yeast extraction,1% NaCl and 1% tryptone (add 15 g/L agar when prepare solid culture)
Super Optimal Broth (SOB) 0.5% yeast extraction, 0.05% NaCl and 2% tryptone (add 15 g/L agar when prepare solid culture) (add 5ml 2 mol/L MgCl2 before use)
Method
1. Plasmid construction

Our fragments was PCR amplified with KOD (TOYOBO®) or PrimeSTAR (Takara®) according to product length.

Product is recycled with gel extraction kit from OMEGA® after electrophoresis.

ClonExpress® II One Step Cloning Kit (Vyzyme) was used to ligate every fragment to construct the most plasmids.

All plasmid constructs were confirmed by sequencing at Sangon®, Inc. (Wuhan,China).

A single frozen glycerol stock was used throughout this study for each bacterial strain.

2. Transformation

1. Add 3-5μl plasmid to 50μl F-trans5α (Weidi Biotechnology) competent cells and incubate 5min in ice , coated plates, select monoclonal colony PCR. Add extra 42℃ heat shock 45s and incubate 10min step will increase transformation efficiency. Or 1.5kv, 4-5ms electroporate cell with 300-400 ng purified plasmid. Recover at 37°C 950 rpm for 1h.

2. Plated on LB agar plates containing appropriate concentration of antibody for selection, grown overnight at 37°C. And prepare PCR reaction to select individual bacterial colony.

3. Fluorescence/growth measurememt

Cell are cultured overnight in LB broth containing corresponding antibiotics, and diluted to OD is 0.1 with fresh LB broth.

Expression was induced at early log phase by addition of different ATc (150 ng/ml–15μg/ml) concentrations. Culture the plate in 37℃, 150 rpm. Every hour put it into a plate reader to measure its fluorescence/OD1.

Modeling impact our experiment

The higher ATc level might thwart bacterial growth. So we need to analyze a proper concentration of ATc, We design a modeling to predict a suitable concentration of ATc (More result about our model please check modeling: Chemical control model). We induced our engineered strain with gradients of ATc. Take 100μl culture to plate on LB agar plates containing appropriate concentration of antibody after 5 minutes, 30 minutes, 90 minutes of induce and counting Colony Forming Units the next day. The results fit the model within a range of ATc. So we choose a appropriate concentration of ATc (16μg/ml), aiming to maximize the expression of GSDMD-N275 and minimize the negative effect of bacteria growth.

Reference

1. Becskel, A. & Serrano, L. Engineering stability in gene networks by autoregulation. Nature 405, 590–593 (2000).

Experiments

Material

Method

Modeling impact our experiment

Back to Top
Improve InterLab Notebook