担当：童　締め切9/26　Introduction 私たちは、Na+を効率よくとりこむusefulな酵母を作成し、モデリングによりある量のNa+を回収するのに必要な酵母投入量を割り出すことを目指しました。そのために、たくさんの研究がなされているシロイヌナズナや、塩生植物の遺伝子をもとにして、効率よくNa+を取り込むような系をデザインしました。 そしてバイオセーフティーのために酵母を凝集させることを試みました。

Design 参考文献については、あとでつけていきます。 Introduction 私たちは、溶液を目的のNa+濃度まで下げるusefulな酵母の作成を目指しました。まずは酵母投入量が少なくて済むように、そしてNa+以外のイオン回収の影響を最小限にするため(Na+の選択性を高めるため←これは必要なのか？)、効率よくNa+を取り込むような系をデザインしました。 そして酵母を回収しやすくするために凝集させることを試みました。 Table content ・塩吸収酵母(リンクをはって、該当セクションへ) 　・細胞膜上のトランスポーターのmodify 　・耐塩性 　・液胞膜上トランスポーター ・凝集酵母(リンクをはって、該当セクションへ) ・塩吸収酵母 (まずは概要) 私たちは、酵母に以下の３つの点を遺伝子工学的に改変することによりNa+取り込み系を実現します. まず,細胞膜のNa+透過性を上げ,速度論的にNa+取り込みを改善します. 次にシャペロン・適合溶質の発現により塩耐性を付加し,さらに細胞の生存率上昇を見込みます. 最後に液胞膜上にATP依存性NA+取り込み系を構築することで,全体としてのNa+取り込みを能動的にし,また細胞内Na+濃度上昇を低減させ細胞の生存率を上げます。 細胞膜上トランスポーターのmodify 細胞膜上のNa+輸送に関わるトランスポーターをノックアウトしたり導入したりすることで、細胞膜のNa+透過性を上げ、速度論的にNa+取り込みをimproveします。 ・Na+を外部に流出するトランスポーターとして、ENA1,NHA1に注目し、以下のノックアウト株作成を試みました。 NHA1Δ、ENA1Δ、NHA1ΔENA1Δ、ENA1,2,5Δ、ENA1,2,5ΔNHA1Δ(正しい表記がわかりません) 外のトランスポーターを×しているイラスト(Aachenを参考に) ENA1: the first member of a tandem array of genes encoding nearly, but not perfectly, identical P-Type ATPases.[1] NHA1: ・Na+を内部に取り込むトランスポーターとして、シロイヌナズナ由来のAtHKT1,アイスプラント由来のMcHKT2に注目しました。どちらのパフォーマンスがいいか選別します。いい方を導入し、Na+の取り込み促進を狙います。 外のトランスポーターは灰色とかで目立たなくして、細胞膜上でNa+を取り込むイラスト 耐塩性 自分たちの酵母の、高塩濃度下での生存率を高めて応用可能塩濃度範囲を広げるため、耐塩性の付与を試みました。 塩生植物(halophyte)であるマングローブ由来のシャペロン様タンパク質マングリン、耐塩性を持つ醤油酵母のグリセロール代謝に関わるZrFPS1,ZrGPD1。この2種のどちらが酵母の耐塩性上昇においてよいパフォーマンスをするか、選別します。その導入により酵母の適応塩濃度範囲をexpandします。 イラスト 液胞膜上トランスポーター Na+は様々な酵素の活性を阻害するので(参考)、液胞に隔離させるために、AntiporterNHX1とH+-PpaseAVP1を導入することでNa+取り込み機構を構築します。 NHX1として、シロイヌナズナ由来のAtNHX1をDNAシャッフリングにより活性を高めたAtNHXS1と、2種類の塩生植物のNHX1をDNAシャッフリングしたSseNHX1の２つがあり、どちらがよりよいパフォーマンスをするか選別します。 液胞膜上にトランスポーターがあってNa+を取り込むイラスト ・凝集酵母 私たちの酵母によって目的の塩濃度まで下げたあと、酵母を回収しやすくするためにそれらを凝集させる系の確立を目指しました。そのためにsurface displayを介してSdrG-FgβF3結合という共有結合に匹敵するほど強力なタンパク質間結合を利用しました。 surface displayにおいて、パッセンジャーを表層提示するためにsed1 anchoringドメインを用いました。 (もう少し詳しくすべき？？) SdrG-Fgβのあの、リボンモチーフのかっこいい写真のせる？？ イラストもあればわかりやすいのかな アッセイの方法、つまり「flagタグの磁気ビーズを使って…」とかはresultに入れればいいだろう…？？

Reference

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