Difference between revisions of "Team:SJTU-BioX-Shanghai/Protocol"

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Revision as of 08:06, 16 October 2018

Protocol

Section1

  • Western Blotting protocol

    1、Prepare of Proteins
    1.1 Culture E.coli BL21(DE3) with LB(l) medium overnight at 37℃, 200rpm
    1.2 Add 1ml overnight culture into 5ml new LB(l) medium for 1 hour at 37℃, 200rpm
    1.3 Induce culture by IPTG (with final concentration of 0.5mM) more than 4 hours, while the OD600 is 0.6
    1.4 (Lysis) Add 1.5ml lysozyme (1mg/ml) into 2ml centrifuged and the supernatant discadred strain, 30℃ for 30 minutes
    1.5 (Degeneration) Add SDS loading buffer and put the centrifugal tube into boiled water for 10 minutes
    2、Prepare SDS-PAGE gel, Running buffer, Trans buffer and TBST Washing buffer
    SDS-PAGE:
    12% Separation Gel(the lower gel):
    30%Acr-Bis      3.2ml
    1.5M Tris-HCl(pH=8.8) 2ml
    10%SDS         80μl
    10%AP          80μl
    TEMED         3μl
    H2O         2.64ml
    Total         8ml
    5% Spacer Gel(the upper gel):
    30%Acr-Bis      500μl
    1.5M Tris-HCl(pH=6.8) 500μl
    10%SDS         40μl
    10%AP         30μl
    TEMED         3μl
    H2O         2ml
    Total         3ml
    1×Running buffer:
    Tris      3.03g
    Glycine    14.4g
    10%SDS    10ml
    Add ultra pure water to 1L
    Store at 4℃
    1×Trans buffer:
    Tris      3.03g
    Glycine    14.4g
    10%SDS     10ml
    Methanol    200ml
    Add ultra pure water to 1L
    Store at 4℃
    1×TBS buffer:
    Tris      2.4g
    NaCl     8.7g
    Adjust pH=7.6 with HCl
    Add ultra pure water to 1L
    TBST Washing buffer:
    TBS        500ml
    Tween-20     250μl
    Blocking buffer:
    Add 2.5g no-fat dry milk into 50ml TBST Washing buffer
    Prepare Blocking buffer only when using it
    3、Protein transfer and Immunodetection
    3.1 Add 15μl sample and 5μl Protein marker
    3.2 Add Running buffer for electrophoresis with a constant voltage at 100V for about 25 minutes, then change voltage into 200V for 40 minutes (adjust the former time by the marker)
    3.3 Open the package and cut the upper spacer gel
    3.4 Prepare the same size PVDF membrane and put into Trans buffer for 5 minutes before trans-membrane
    3.5 Open gel cassettes and put the gel on the PVDF membrane sandwiched between two pieces of blotting paper(always filter paper)
    Mind the order of gel and PVDF membrane between the electrodes, black end with gel for negative electrode and white end with PVDF membrane for positive electrode.
    3.6 Add Trans buffer for electrophoresis with a constant current at 350mA for 65 minutes(Crowd with ice at a 4℃ temperature )
    3.7 After trans-membrane, wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
    3.8 Add 10ml Blocking buffer with gentle shaking for 1 hour at room temperature or 4℃ overnight
    3.9 Wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
    3.10 Add 10ml diluted(1:5000) primary antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (primary antibody can be used repeatedly for 10 times)
    3.11 repeat step 3.9
    3.12 Add 10ml diluted secondary conjugated antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (seconfary antibody needn’t be repeatedly used)
    3.13 repeat step 3.9
    3.14 With the ratio of 1:1 to mix Luminous substrate A and B, typically 200-400μl mixture added on PVDF membrane
    3.15 Take photos by specific machine and store it

    • Instructions: you have the change not only the main text, but also have to modify the text in the navgation bar on the left side. Now put your content here and do the same for the following sections. xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx Note template is here --- OD OD Optical density .

    Mouse experiments

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    • Your title1

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    • Your title2

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    • Your title3

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    Section3

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    2018 Interlab Plate Reader Protocol
    Protocols/Transformation

    • Western Blotting protocol

      1、Prepare of Proteins
      1.1 Culture E.coli BL21(DE3) with LB(l) medium overnight at 37℃, 200rpm
      1.2 Add 1ml overnight culture into 5ml new LB(l) medium for 1 hour at 37℃, 200rpm
      1.3 Induce culture by IPTG (with final concentration of 0.5mM) more than 4 hours, while the OD600 is 0.6
      1.4 (Lysis) Add 1.5ml lysozyme (1mg/ml) into 2ml centrifuged and the supernatant discadred strain, 30℃ for 30 minutes
      1.5 (Degeneration) Add SDS loading buffer and put the centrifugal tube into boiled water for 10 minutes
      2、Prepare SDS-PAGE gel, Running buffer, Trans buffer and TBST Washing buffer
      SDS-PAGE:
      12% Separation Gel(the lower gel):
      30%Acr-Bis      3.2ml
      1.5M Tris-HCl(pH=8.8) 2ml
      10%SDS         80μl
      10%AP          80μl
      TEMED         3μl
      H2O         2.64ml
      Total         8ml
      5% Spacer Gel(the upper gel):
      30%Acr-Bis      500μl
      1.5M Tris-HCl(pH=6.8) 500μl
      10%SDS         40μl
      10%AP         30μl
      TEMED         3μl
      H2O         2ml
      Total         3ml
      1×Running buffer:
      Tris      3.03g
      Glycine    14.4g
      10%SDS    10ml
      Add ultra pure water to 1L
      Store at 4℃
      1×Trans buffer:
      Tris      3.03g
      Glycine    14.4g
      10%SDS     10ml
      Methanol    200ml
      Add ultra pure water to 1L
      Store at 4℃
      1×TBS buffer:
      Tris      2.4g
      NaCl     8.7g
      Adjust pH=7.6 with HCl
      Add ultra pure water to 1L
      TBST Washing buffer:
      TBS        500ml
      Tween-20     250μl
      Blocking buffer:
      Add 2.5g no-fat dry milk into 50ml TBST Washing buffer
      Prepare Blocking buffer only when using it
      3、Protein transfer and Immunodetection
      3.1 Add 15μl sample and 5μl Protein marker
      3.2 Add Running buffer for electrophoresis with a constant voltage at 100V for about 25 minutes, then change voltage into 200V for 40 minutes (adjust the former time by the marker)
      3.3 Open the package and cut the upper spacer gel
      3.4 Prepare the same size PVDF membrane and put into Trans buffer for 5 minutes before trans-membrane
      3.5 Open gel cassettes and put the gel on the PVDF membrane sandwiched between two pieces of blotting paper(always filter paper)
      Mind the order of gel and PVDF membrane between the electrodes, black end with gel for negative electrode and white end with PVDF membrane for positive electrode.
      3.6 Add Trans buffer for electrophoresis with a constant current at 350mA for 65 minutes(Crowd with ice at a 4℃ temperature )
      3.7 After trans-membrane, wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
      3.8 Add 10ml Blocking buffer with gentle shaking for 1 hour at room temperature or 4℃ overnight
      3.9 Wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
      3.10 Add 10ml diluted(1:5000) primary antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (primary antibody can be used repeatedly for 10 times)
      3.11 repeat step 3.9
      3.12 Add 10ml diluted secondary conjugated antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (seconfary antibody needn’t be repeatedly used)
      3.13 repeat step 3.9
      3.14 With the ratio of 1:1 to mix Luminous substrate A and B, typically 200-400μl mixture added on PVDF membrane
      3.15 Take photos by specific machine and store it

      • Instructions: you have the change not only the main text, but also have to modify the text in the navgation bar on the left side. Now put your content here and do the same for the following sections. xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx Note template is here --- OD OD Optical density .

      Section

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      • Your title2

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      • Your title3

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      2018 Interlab Plate Reader Protocol
      Protocols/Transformation

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      Fig 1. The particle standard curve obtained form the 2nd calibration experiment.

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    Fig 1. The particle standard curve obtained form the 2nd calibration experiment.

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    The table template is here.

    Table 1. Colony forming units per 0.1 OD600

    samples dilution factor CFU/mL
    8×104 8×105 8×106
    1.1 TNTC 48 11 3.84E+07
    1.2 248 41 10 3.28E+07
    1.3 172 54 5 4.32E+07
    2.1 TNTC 143 20 1.14E+08
    2.2 TNTC 153 25 1.22E+08
    2.3 TNTC 151 18 1.21E+08
    3.1 TNTC 119 16 9.52E+07
    3.2 TNTC 125 19 1.00E+08
    3.3 TNTC 89 18 7.12E+07
    4.1 TNTC 209 16 1.67E+08
    4.2 TNTC 130 17 1.04E+08
    4.3 TNTC 164 10 1.31E+08

    US imaging

    We use the Fujifilm VisualSonics / VEVO LAZR-X imaging system and MX250 transducer. The application is set to VA Phantom. Parameters are listed below:

    • Frequency: 21MHz
    • Power for imaging: min(2%)
    • Power for collapse: max(100%) (sustaining for 5 minutes)
    • Max frame: 50
    • Gain: 16dB
    • Focus: adjust to the depth of the layer where engineered E.coli lies in.
    • Field of view: adjust to achieve the maximum repression of noise and also zoom in on the interest region as much as possible.

    Preparation before imaging: PBS solution is needed to cover the imaging samples allowing the transducer to dip into the solution. Pay attention to not producing any unwanted bubbles.