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Revision as of 13:11, 16 October 2018



Notebook



Project

Here you will find how project was developed, step by step, mistake by mistake.

Collapsible2 Set:

Day 08/05/2018 Br

We contacted Evandro José Mulinari, a doctorate and researcher from USP of São Carlos, in the biochemestry departament. We've figured out that he works with laccase.

18/05/2018

We had a meeting with Mulinari to discuss about our project and he accepted to give us a sample of his laccase.

03/07/2018

  • INTERLAB 1
    • Foi feito a calibração do TECAN (calibração 1 e 2). O 3 não deu certo.
  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 1
    • Inoculamos E. coli DH5a da NEB para fazer célula competente.
  • LACASE TT 1
    • We received the Mulinari’s laccase in our laboratory.
    • Foi feito estoque da E. coli Rosetta Gami 2 com a lacase tt com glicerol 20% raspando toda a placa para pegar as colônias;
    • Foi feito propagação da E. coli Rosetta para fazer estoque para o professor Segato e para o time iGEM. Também será feito o Miniprep para obtermos o plasmídeo com o gene.

04/07/2018

  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 2
    • A DH5a inoculada no dia anterior cresceu bastante;
    • Preparou TSS buffer esterilizou com membrana de 0,2 nm;
    • Autoclavou os equipamentos para fazer
    • célula competente.
    • Inocular DH5a overnight para competente cell
  • LACASE TT 2
    • A Rosetta propagada overnight desde o dia anterior cresceu bem. Fez estoque para o professor Segato e para o time iGEM 2018.
    • Fez miniprep da Rosetta para pegar os plasmídeo (3 tubos com 30 ul cada).

05/07/2018

  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 3
    • Inocular DH5a no Erlenmeyer e acompanhar OD até 0,2 a 0,5. Foi até 0,46
    • Fez as células competente congelando no nitrogênio líquido.

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02/08/2018

  • LACASE TT 3
    • Entramos em contato com o Mulinari. Ficamos de conversar com ele sobre usar ou não o sonicar do professor Valdeir.

06/08/2018

  • LACASE TT 4
    • Recebemos o protocolo de produção e purificação da lacase pelo Mulinari.
    • Tiramos o máximo de dúvida com o Mulinari e fizemos planejamento para conseguirmos realizar os experimentos;
    • Preparou 2L de meio de cultura e autoclavou.
    • Autoclavou também 2 Erlenmeyer de 2L;

07/08/2018

  • LACASE TT 5
    • foi inoculada a bactéria em meio de cultura no Erlenmeyer de 2 L com 1L de meio. Foi inoculado às 16h 37 C e 130 rpm.
    • Foi feito acompanhamento de O.D para que quando chegasse em 0,6 adicionar a solução de sulfato de cobre para a produção de lacase. Assim que adicionar a solução de cobre a baixar a temperatura para 18 C
    • A O.D demorou muito para subir. O planejamento foi baseado na cinética de crescimento da E. coli Turbo. A rosetta demora muito pra crescer. Conversamos com o Mulinari para ver uma saída. Ele disse que pode deixar em 20 C e adicionar sulfato de cobre e deixar overnight.

08/08/2018

  • LACASSE TT 6
    • A rosetta cresceu, deixou o meio bem turvo.
    • Centrifugamos a 4000 rpm por 1h, no laboratório do professor Valdeir com a ajuda da Bárbara, os 2 L de meio e ressuspendemos a bactéria diretamente no tampão de lise. Ressuspendemos em tampão de lise diretamente e deixamos congelados -80 C até o dia seguinte.

09/08/2018

  • LACASE TT 7
    • Fizemos o lise celular por ultrassom de acordo com o protocolo do mulinari com a ajuda da Bárbara. Pulso de 30 em 30 segundos, 40% de potência e 40 C máxima de 40 C. Colocamos o béquer no banho de gelo para não subir muito a temperatura.
    • Centrifugamos novamente (11000 rpm 90 min) para separar os restos celulares do meio líquido, pois a enzima está no meio líquido. Pegamos o sobrenadante e reservamos.
    • Medir a concentração de proteína total por Bradford. Deu errado, ficou com mais fases, provavelmente por causa que tem restos de células. Resolvemos centrifugar tudo em tubos de 2 ml para pelletar os restos celulares, pegamos o sobrenadante e passamos no concentrador.
    • Começamos a equilibrar a coluna do AKTA para a purificação em coluna de níquel.
    • Concentramos o extrato (aprox. 100 ml) até cerca de 40 ml.
    • Estava demorando demais para concentrar, então o professor Segato pegou 5 ml do extrato semi concentrado e purificou no AKTA, para ver se a enzima estava presente no extrato.
    • Correl o gel de proteína das frações que o professor purificou e deixamos corando até amanhã.
    • Continuamos a concentrar até 40 ml. Ficamos até 20h concentrando

10/08/2018

  • LACADE TT 8
    • Descoramos o gel da fração do professor. A enzima saiu bem purificada. Foi detectado a proteína nas concentrações de 34,5% ~46% de tampão B 500 mM.
    • Purificar o concentrado com loop de 10 ml do professor Ferraz. Não purificou tudo, dos 40 ml purificou 10 ml. Ainda falta 30 ml.
    • Fizemos 3 géis de proteína para uso posterior.
    • Corremos o gel das frações e deixa,os corando até segunda feira que vem (13/08/2018)

Day 13/08/2018 Br

  • LACASE TT 9
    • Descoramos o gel do dia 10/082018
    • O professor Segato purificou mais 20 ml de extrato concentrado. Falta 10 ml.
    • Pegar as frações 14 ~21 das duas purificações e juntar a purificação do dia 10/08/2018 e concentrar, lavando com tampão A (tampão A sem imidazol) para tirar o imidazol.
  • We received our gene from IDT

14/08/2018

  • LACASE TT 10
    • Foi purificado de novo no AKTA, agora sem imidazol
    • Corremos o gel do AKTA.
  • PROJETO 1
    • Foi discutido qual promotor usar. Achamos o promotor LacI já no vetor pSB1C3 no kit plate 3 - 4G do kit iGEM 2018

15/08/2018

  • PROJETO 2
    • Fizemos solução TE pH 8 para ressuspender o DNA sintético.
    • Fizemos 4 géis de proteína.
    • Foi feito Gibson dos gBlocks. Usar 2 ul de cada gBlock.
    • Acabou a luz ás 13:50. Iriamos fazer PCR mas não deu
    • Fomos embora ás 15:10 e ainda não tinha voltado a luz;

16/08/2018

  • PROJETO 3
    • Foi feito PCR e corremos o gel (Taise)
    • Foi feito purificação do PCR e corremos o gel (Gustavo)

17/08/2018

  • PROJETO 4
    • Fazer 3A Assembly seguindo o protocolo do iGEM (1 vez).
    • Foi feito transformação em DH5a para confirmar se deu certo a inserção do gene
    • Fizemos estoque de SOC que ganhamos de patrocínio, pois do professor Segato tinha acabado.

18/08/2018

  • PROJETO 5
    • Deu errado a transformação, então isso quer dizer que 3A Assembly deu errado.
    • Transformamos o promotor LacI od kit iGEM para não perdermos ele. Foi feito em DH5a.
    • Não seguir o protocolo do iGEM. Fazer reação de digestão separado. Não colocar as duas enzimas juntas, pois como o sítio de restrição está muito próximo, pode ser que isso esteja atrapalhando. (2 vez)

19/08/2018

  • PROJETO 6
    • As transformações do promotor deu certo. Fazer propagação.
    • As digestões deu errado de novo.
    • Fazer digestão utilizando uma enzima por vez. Antes de correr o gel purificar, pois pode ser que as enzimas estão atrapalhando a correr gel. (3 vez)

20/08/2018

  • PROJETO 7
    • Foi feito Miniprep do promotor.
    • A digestão não deu certo de novo.
    • O professor orientou o seguinte: após confirmar o gel, prosseguir para a próxima digestão. Na hora de correr o gel não reutilizar o gel e sempre usar tampão novo na cuba.

21/08/2018

  • PROJETO 8
    • Fazer as digestões de novo (4 vez)
    • Transformação de ligação do Phoma e Pleurotus
    • Fazer PCR dos genes. Lembrar de purificar antes.
      • gene do pleurotus OK
      • gene do phoma tá degradado. Tem que fazer outro PCR.

22/08/2018

  • PROJETO 9
    • Cresceram algumas colônias dos dois genes. Fazer PCR de colônia. Foi utilizado TAQ que o Fernando ganhou ao invés de usar a Phusion.
    • O PCR de colônia deu errado. Não dava pra ver nem borrão do gene. Só os primers…

23/08/2018

  • PROJETO 10
    • Conversamos com o professor Segato para ver o que estamos fazendo errado.
    • Foi discutido uma possível contaminação do kit de purificação do PCR.
    • Fazer testes dos kit para descobrir o que está contaminado. Foi cedida genes do projeto do professor para usarmos como controle no PCR.
    • Os dois kits testados deram certos…
    • O professor vai viajar dia 24/08 até dia 10/09/2018. Não mexer com biologia molecular até ele voltar.

27/08/2018

  • LACASE TT 11
    • Fazer tampão para purificar a lacase. É a etapa 3.3.4 do protocolo do Mulinari

29/08/2018

  • LACASE TT 12
    • Equilibrar a coluna do AKTA com o tampão. A Bianca, Awana e Aline ajudaram.

30/08/2018

  • LACASE TT 13
    • A Aline purificou a lacase pra nós, pois estávamos em visita técnica
    • Correr o gel de proteína das frações purificadas.

31/08/2018

  • LACASE TT 14
    • Descoramos o gel e separamos as frações com enzima
    • Fizemos a atividade enzimática (Gustavo). Não deu certo, pois a lacase tt é termofílico e não colocada nas condições ótimas dela.

01/09/2018~09/09/2018 Recesso escolar

  • LACASE TT 15
    • Fizemos a caracterização de pH e temperatura. Achamos pH 4 e temperatura de 60 °C.

10/09/2018

  • LACASE TT 15
    • Caracterizar a lacase para ver se degrada BPA e inibição por F- e ClO-
    • Fizemos solução BPA 250 uM (0,057 g/L). A concentração real foi de 0,055g/L
    • A inibição por cloro não deu certo, pois o cloro descolore o ABTS e não dá pra saber se a lacase teve ou não atividade.
    • Utilizamos o espectrofotômetro do professor Valeir, pois ela esquenta

11/09/2018

  • PROJETO 11
    • Confirmou a integridade o gene por PCR. O gene de Pleurotus foi bom. O do Phoma não ficou muito bom
  • Varredura dos componentes da reação de degradação de BPA.
    • BPA, Tampão acetato pH 4,0, Enzima, Enzima fervida + BPA
    • BPA tem pico em 230 nm e 276 nm. Fizemos as curvas padrão para os dois comprimento de onda.

12/09/2018

  • PROJETO 12
    • Fazer digestão de novo (5ª vez)
    • Acabou o PCR e fizemos mais, desde a parte do Gibson.
    • Deu errado o Gibson.
    • Deixar a segunda parte da digestão overnight

13/09/2018

  • PROJETO 13
    • Recebemos nonilfenol REDEX 95 (o Paulinho trouxe);
    • Pegamos 10 colônias da placa da transformação do PHOMA do dia 22/08/2018 e inoculamos em 1 mL de meio LB com cloranfenicol para ver se as células ainda estavam viáveis. Caso estejam vivas será feito PCR de colônia. Deixar no meio LB overnight.
    • Corremos o gel da digestão e deu positivo para Pleurotus, mas Phoma não deu muito certo. Mesmo assim seguimos para ligação dos dois genes.

14/09/2018

  • PROJETO 14
    • As 10 colônias cresceram (deixou o meio turvo).
    • Fazer PCR de colônias das 10 colônias. A temperatura de anelamento foi de 67°C e tempo de extensão foi de 2 min;
    • Fazer PCR dos genes do Pleurotus e Phoma com tempo temperatura de anelamento de 64 °C, 66 °C e 68 °C para conferir qual temperatura é a melhor.
    • PCR de colônia do Phoma deu certo (100% positivo), no entanto as bandas não correspondem com o tamanho esperado. Mas se apareceu banda usando primer do gene, não tem como ter dado errado. Conversar com professor sobre o resultado.
    • PCR dos genes do pleurotus de certo em todas as temperaturas, no entanto do Phoma deu certo só em 68 °C e ainda a banda ficou muito fraco, tão fraco que para enxergar teve que ajustar a nitidez, contraste e brilho da foto.

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https://www.w3schools.com/howto/tryit.asp?filename=tryhow_js_collapsible

Interlab

Some news this fine day!

Collapsible2 Set:

Day 08/05/2018 Br

We contacted Evandro José Mulinari, um doutorando e pesquisador da USP de Sõa Carlos, no departamento de ..., because we learned that he work with laccase.

18/05/2018

We had a meeting with Mulinari to discuss about our project. So he accepted give in his laccase for us.

03/07/2018

  • INTERLAB 1
    • Foi feito a calibração do TECAN (calibração 1 e 2). O 3 não deu certo.
  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 1
    • Inoculamos E. coli DH5a da NEB para fazer célula competente.
  • LACASE TT 1
    • We received the Mulinari’s laccase in our laboratory.
    • Foi feito estoque da E. coli Rosetta Gami 2 com a lacase tt com glicerol 20% raspando toda a placa para pegar as colônias;
    • Foi feito propagação da E. coli Rosetta para fazer estoque para o professor Segato e para o time iGEM. Também será feito o Miniprep para obtermos o plasmídeo com o gene.

04/07/2018

  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 2
    • A DH5a inoculada no dia anterior cresceu bastante;
    • Preparou TSS buffer esterilizou com membrana de 0,2 nm;
    • Autoclavou os equipamentos para fazer
    • célula competente.
    • Inocular DH5a overnight para competente cell
  • LACASE TT 2
    • A Rosetta propagada overnight desde o dia anterior cresceu bem. Fez estoque para o professor Segato e para o time iGEM 2018.
    • Fez miniprep da Rosetta para pegar os plasmídeo (3 tubos com 30 ul cada).

05/07/2018

  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 3
    • Inocular DH5a no Erlenmeyer e acompanhar OD até 0,2 a 0,5. Foi até 0,46
    • Fez as células competente congelando no nitrogênio líquido.

23/07/2018

  • INTERLAB 2
    • Começamos o INTERLAB.
    • Fizemos 1,2 L de LB e autoclavar. Esse volume foi calculado para conseguir fazer o INTERLAB inteiro sem precisar fazer mais.
    • Fizemos as transformações do interlab utilizando DH5a. Os genes transformados são os do protocolo INTERLAB 2018;
      • Device Part Number Plate Location
      • Negative control BBa_R0040 Kit Plate 7 Well 2D
      • Positive control BBa_I20270 Kit Plate 7 Well 2B
      • Test Device 1 BBa_J364000 Kit Plate 7 Well 2F
      • Test Device 2 BBa_J364001 Kit Plate 7 Well 2H
      • Test Device 3 BBa_J364002 Kit Plate 7 Well 2J
      • Test Device 4 BBa_J364007 Kit Plate 7 Well 2L
      • Test Device 5 BBa_J364008 Kit Plate 7 Well 2N
      • Test Device 6 BBa_J364009 Kit Plate 7 Well 2P

24/07/2018

  • INTERLAB 3
    • As transformação deu errado, pois não fizemos a etapa do SOC e inoculamos na placa direto. A culpa foi do Fernando, pois a Cibele tinha perguntado se tinha que inocular no meio SOC primeiro.
    • Refazer as transformações seguindo o protocolo correto, inoculando no meio SOC.
    • Esse dia o Bruno veio pro laboratório e fez transformação fúngica. Como não sabíamos, ficamos esperando ele acabar, mas acabou às 17h. Mas todos os alunos da pós, incluindo o Bruno, foram embora. Explicamos a situação para o professor e ele deixou ficar no laboratório para terminar a transformação.

25/07/2018

  • INTERLAB 4
    • As transformações deram certo.
    • Seguimos com o protocolo INTERLAB 2018 “Day 2”;

26/07/2018

  • INTERLAB 5
    • As propagações deram certo. Cresceram bem;
    • Foi medido apenas as absorbâncias, pois não foi possível ler excitação, emissão e nem fluorescência.
    • Foi feito a parte de contagem de UFC do protocolo INTERLAB 208. Pegou-se as propagações das transformações dos controles negativo e positivo e foi feito diluição de acordo com o protocolo. Foi então inoculado nas placas e deixou crescer 24h.

27/07/2018

  • INTERLAB 6
    • Seguir para a segunda parte do protocolo de UFC. Cresceram muitas colônias. As diluições não foram tão bem sucedidas, mas deu para confirmar que a diluição de fato foi feita, pois a quantidade de colônia foi diminuindo de uma placa para outra.
    • Não foi feita as contagens das colônias, pois era muito difícil de contar devido a quantidade enorme de colônias. A mais diluída haviam mais de 200 colônias;

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Human Practices

Get in touch, or swing by for a cup of coffee.

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Day 08/05/2018 Br

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18/05/2018

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03/07/2018

  • INTERLAB 1
    • Foi feito a calibração do TECAN (calibração 1 e 2). O 3 não deu certo.
  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 1
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  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 2
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05/07/2018

  • CÉLULA COMPETENTE DH5A 3
    • Inocular DH5a no Erlenmeyer e acompanhar OD até 0,2 a 0,5. Foi até 0,46
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