Western Blotting protocol

1、Prepare of Proteins
1.1 Culture E.coli BL21(DE3) with LB(l) medium overnight at 37℃, 200rpm
1.2 Add 1ml overnight culture into 5ml new LB(l) medium for 1 hour at 37℃, 200rpm
1.3 Induce culture by IPTG (with final concentration of 0.5mM) more than 4 hours, while the OD600 is 0.6
1.4 (Lysis) Add 1.5ml lysozyme (1mg/ml) into 2ml centrifuged and the supernatant discadred strain, 30℃ for 30 minutes
1.5 (Degeneration) Add SDS loading buffer and put the centrifugal tube into boiled water for 10 minutes
2、Prepare SDS-PAGE gel, Running buffer, Trans buffer and TBST Washing buffer
SDS-PAGE:
12% Separation Gel(the lower gel):
30%Acr-Bis      3.2ml
1.5M Tris-HCl(pH=8.8) 2ml
10%SDS         80μl
10%AP          80μl
TEMED         3μl
H2O         2.64ml
Total         8ml
5% Spacer Gel(the upper gel):
30%Acr-Bis      500μl
1.5M Tris-HCl(pH=6.8) 500μl
10%SDS         40μl
10%AP         30μl
TEMED         3μl
H2O         2ml
Total         3ml
1×Running buffer:
Tris      3.03g
Glycine    14.4g
10%SDS    10ml
Add ultra pure water to 1L
Store at 4℃
1×Trans buffer:
Tris      3.03g
Glycine    14.4g
10%SDS     10ml
Methanol    200ml
Add ultra pure water to 1L
Store at 4℃
1×TBS buffer:
Tris      2.4g
NaCl     8.7g
Adjust pH=7.6 with HCl
Add ultra pure water to 1L
TBST Washing buffer:
TBS        500ml
Tween-20     250μl
Blocking buffer:
Add 2.5g no-fat dry milk into 50ml TBST Washing buffer
Prepare Blocking buffer only when using it
3、Protein transfer and Immunodetection
3.1 Add 15μl sample and 5μl Protein marker
3.2 Add Running buffer for electrophoresis with a constant voltage at 100V for about 25 minutes, then change voltage into 200V for 40 minutes (adjust the former time by the marker)
3.3 Open the package and cut the upper spacer gel
3.4 Prepare the same size PVDF membrane and put into Trans buffer for 5 minutes before trans-membrane
3.5 Open gel cassettes and put the gel on the PVDF membrane sandwiched between two pieces of blotting paper(always filter paper)
Mind the order of gel and PVDF membrane between the electrodes, black end with gel for negative electrode and white end with PVDF membrane for positive electrode.
3.6 Add Trans buffer for electrophoresis with a constant current at 350mA for 65 minutes(Crowd with ice at a 4℃ temperature )
3.7 After trans-membrane, wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
3.8 Add 10ml Blocking buffer with gentle shaking for 1 hour at room temperature or 4℃ overnight
3.9 Wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
3.10 Add 10ml diluted(1:5000) primary antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (primary antibody can be used repeatedly for 10 times)
3.11 repeat step 3.9
3.12 Add 10ml diluted secondary conjugated antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (seconfary antibody needn’t be repeatedly used)
3.13 repeat step 3.9
3.14 With the ratio of 1:1 to mix Luminous substrate A and B, typically 200-400μl mixture added on PVDF membrane
3.15 Take photos by specific machine and store it

Instructions: you have the change not only the main text, but also have to modify the text in the navgation bar on the left side. Now put your content here and do the same for the following sections. xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx Note template is here --- OD OD Optical density .

Mouse experiments

Section3

xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx. The text-link template is here.

• Western Blotting protocol

  1、Prepare of Proteins
  1.1 Culture E.coli BL21(DE3) with LB(l) medium overnight at 37℃, 200rpm
  1.2 Add 1ml overnight culture into 5ml new LB(l) medium for 1 hour at 37℃, 200rpm
  1.3 Induce culture by IPTG (with final concentration of 0.5mM) more than 4 hours, while the OD600 is 0.6
  1.4 (Lysis) Add 1.5ml lysozyme (1mg/ml) into 2ml centrifuged and the supernatant discadred strain, 30℃ for 30 minutes
  1.5 (Degeneration) Add SDS loading buffer and put the centrifugal tube into boiled water for 10 minutes
  2、Prepare SDS-PAGE gel, Running buffer, Trans buffer and TBST Washing buffer
  SDS-PAGE:
  12% Separation Gel(the lower gel):
  30%Acr-Bis      3.2ml
  1.5M Tris-HCl(pH=8.8) 2ml
  10%SDS         80μl
  10%AP          80μl
  TEMED         3μl
  H2O         2.64ml
  Total         8ml
  5% Spacer Gel(the upper gel):
  30%Acr-Bis      500μl
  1.5M Tris-HCl(pH=6.8) 500μl
  10%SDS         40μl
  10%AP         30μl
  TEMED         3μl
  H2O         2ml
  Total         3ml
  1×Running buffer:
  Tris      3.03g
  Glycine    14.4g
  10%SDS    10ml
  Add ultra pure water to 1L
  Store at 4℃
  1×Trans buffer:
  Tris      3.03g
  Glycine    14.4g
  10%SDS     10ml
  Methanol    200ml
  Add ultra pure water to 1L
  Store at 4℃
  1×TBS buffer:
  Tris      2.4g
  NaCl     8.7g
  Adjust pH=7.6 with HCl
  Add ultra pure water to 1L
  TBST Washing buffer:
  TBS        500ml
  Tween-20     250μl
  Blocking buffer:
  Add 2.5g no-fat dry milk into 50ml TBST Washing buffer
  Prepare Blocking buffer only when using it
  3、Protein transfer and Immunodetection
  3.1 Add 15μl sample and 5μl Protein marker
  3.2 Add Running buffer for electrophoresis with a constant voltage at 100V for about 25 minutes, then change voltage into 200V for 40 minutes (adjust the former time by the marker)
  3.3 Open the package and cut the upper spacer gel
  3.4 Prepare the same size PVDF membrane and put into Trans buffer for 5 minutes before trans-membrane
  3.5 Open gel cassettes and put the gel on the PVDF membrane sandwiched between two pieces of blotting paper(always filter paper)
  Mind the order of gel and PVDF membrane between the electrodes, black end with gel for negative electrode and white end with PVDF membrane for positive electrode.
  3.6 Add Trans buffer for electrophoresis with a constant current at 350mA for 65 minutes(Crowd with ice at a 4℃ temperature )
  3.7 After trans-membrane, wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
  3.8 Add 10ml Blocking buffer with gentle shaking for 1 hour at room temperature or 4℃ overnight
  3.9 Wash PVDF membrane with 10ml TBST for 10 minutes with gentle shaking
  3.10 Add 10ml diluted(1:5000) primary antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (primary antibody can be used repeatedly for 10 times)
  3.11 repeat step 3.9
  3.12 Add 10ml diluted secondary conjugated antibody for 2 hours at room temperature or 4℃ overnight with gentle shaking (seconfary antibody needn’t be repeatedly used)
  3.13 repeat step 3.9
  3.14 With the ratio of 1:1 to mix Luminous substrate A and B, typically 200-400μl mixture added on PVDF membrane
  3.15 Take photos by specific machine and store it
  

Instructions: you have the change not only the main text, but also have to modify the text in the navgation bar on the left side. Now put your content here and do the same for the following sections. xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx Note template is here --- OD OD Optical density .

Section

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• Your title1

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• Your title2

  xxx xx xxxx xxx xxx xxx xx xxxx xxx xxxxx xxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxxx xx xxxx xxx xxxxxxx

• Your title3

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Section3

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2018 Interlab Plate Reader Protocol
Protocols/Transformation

section4

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Fig 1. The particle standard curve obtained form the 2nd calibration experiment.

section4

xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx The figure template is here.

Fig 1. The particle standard curve obtained form the 2nd calibration experiment.

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The table template is here.

US imaging

We use the Fujifilm VisualSonics / VEVO LAZR-X imaging system and MX250 transducer. The application is set to VA Phantom. Parameters are listed below:

• Frequency: 21MHz
• Power for imaging: min(2%)
• Power for collapse: max(100%) (sustaining for 5 minutes)
• Max frame: 50
• Gain: 16dB
• Focus: adjust to the depth of the layer where engineered E.coli lies in.
• Field of view: adjust to achieve the maximum repression of noise and also zoom in on the interest region as much as possible.

Preparation before imaging: PBS solution is needed to cover the imaging samples allowing the transducer to dip into the solution. Pay attention to not producing any unwanted bubbles.