Team:Kyoto/Design

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Introduction
私たちは、Na+を効率よくとりこむusefulな酵母を作成し、モデリングによりある量のNa+を回収するのに必要な酵母投入量を割り出すことを目指しました。そのために、たくさんの研究がなされているシロイヌナズナや、塩生植物の遺伝子をもとにして、効率よくNa+を取り込むような系をデザインしました。 そしてバイオセーフティーのために酵母を凝集させることを試みました。

Table of contents

• 1) Halotorelance of yeast
• 2) 塩吸収酵母
• 　・Modification of Transporters on Cellular Membrane
• 　・Modification of Transporters on Vacuolar Membrane
• 3) 凝集酵母

塩吸収酵母

私たちは、酵母に以下の３つの点を遺伝子工学的に改変することによりNa+取り込み系の実現を試みました。次のセクションから詳しく記述します。

Halotorelance of Yeast

自分たちの酵母の、高塩濃度下での生存率を高めて応用可能塩濃度範囲を広げるため、耐塩性の付与を試みました。 塩生植物(halophyte)であるマングローブ由来のシャペロン様タンパク質マングリン、耐塩性を持つ醤油酵母のグリセロール代謝に関わるZrFPS1,ZrGPD1。この2種のどちらが酵母の耐塩性上昇においてよいパフォーマンスをするか、選別します。その導入により酵母の適応塩濃度範囲をexpandします。

Figure1:酵母の耐塩性に貢献する３つのタンパク質。Mangrin:酵母での発現が確認されたシャペロン様タンパク質。ZrGPD1:グリセロール産生に関わるタンパク質、グリセロールが適合溶質として働くと期待される。ZrFPS1:グリセロールの漏出を防ぐタンパク質(mangrin→續さん、Zr:島添君)

Modification of Transporters on Cellular Membrane

細胞膜上のNa+輸送に関わるトランスポーターをノックアウトしたり導入したりすることで、細胞膜のNa+透過性を上げ、速度論的にNa+取り込みをimproveします。 ・Na+を外部に流出するトランスポーターとして、ENA1,NHA1に注目し、以下のノックアウト株作成を試みました。 NHA1Δ、ENA1Δ、NHA1ΔENA1Δ、ENA1,2,5Δ、ENA1,2,5ΔNHA1Δ(正しい表記がわかりません) 外のトランスポーターを×しているイラスト(Aachenを参考に。マングリンたちは灰色などにして目立たなくする)ENA1: the first member of a tandem array of genes encoding nearly, but not perfectly, identical P-Type ATPases.[1] NHA1:

・Na+を内部に取り込むトランスポーターとして、シロイヌナズナ由来のAtHKT1,アイスプラント由来のMcHKT2に注目しました。どちらのパフォーマンスがいいか選別します。いい方を導入し、Na+の取り込み促進を狙います。 外のトランスポーターは灰色とかで目立たなくして、細胞膜上でNa+を取り込むイラスト。AtHKT1:木部に発現するタンパク質で、Na+の輸送に関わるMcHK2:AthKT1のホモログで、塩耐性の強いアイスプラント由来のもの(担当、童と仲里さん) (McHKT2はコンストできなかった、と正直にリザルトで書こうと思う)

Modification of Transporters on Vacuolar Membrane

Na+は様々な酵素の活性を阻害するので(参考)、液胞に隔離させるために、AntiporterNHX1とH+-PpaseAVP1を導入することでNa+取り込み機構を構築します。 NHX1として、シロイヌナズナ由来のAtNHX1をDNAシャッフリングにより活性を高めたAtNHXS1と、2種類の塩生植物のNHX1をDNAシャッフリングしたSseNHX1の２つがあり、どちらがよりよいパフォーマンスをするか選別します。 液胞膜上にトランスポーターがあってNa+を取り込むイラスト AtNHXS1: SseNHX1:(担当田向君だったが)

凝集酵母

私たちの酵母によって目的の塩濃度まで下げたあと、酵母を回収しやすくするためにそれらを凝集させる系の確立を目指しました。そのためにsurface displayを介してSdrG-FgβF3結合という共有結合に匹敵するほど強力なタンパク質間結合を利用しました。 surface displayにおいて、パッセンジャーを表層提示するためにsed1 anchoringドメインを用いました。

表層提示してくっついてるイラスト

Reference

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• [2] Forestry Agency, “Damage of Pine-wood nematodes：Forestry Agency,” 2016. [Online]. Available: http://www.rinya.maff.go.jp/j/hogo/higai/matukui.html. [Accessed: 21-Oct- 2017].
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• [4] A. Y. Ryss, O. A. Kulinich, and J. R. Sutherland, “Pine wilt disease: a short review of worldwide research,” For. Stud. China, vol. 13, no. 2, pp. 132–138, Jun. 2011.
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• [6] Forestry Agency, “The present state of damage of pine-wood nematodes,” 2016. [Online]. Available: http://www.rinya.maff.go.jp/j/hogo/higai/attach/pdf/matukui-1.pdf. [Accessed: 21-Oct-2017].
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• [8] Kyoto Association for the Promotion of Traditional Culture of forest, “Danger of Kyoto's three representative mountains,” 2007. [Online]. Available: http://www.kyoto-dentoubunkanomori.jp/topics/img/brochure.pdf. [Accessed: 21-Oct-2017].
• [9] T. Kiyohara and Y. Tokushige, “Inoculation Experiments of a Nematode, Bursaphelenchus sp., onto Pine Trees,” J. JAPANESE For. Soc., 1971.
• [10]C. Vicente, M. Espada, P. Vieira, and M. Mota, “Pine Wilt Disease: a threat to European forestry,” Eur J Plant Pathol, vol. 133, pp. 89–99, 2012.
• [11]Rejendra Singh and Swastik Phulera, “Plant Parasitic Nematodes: The Hidden Enemies of Farmers,” Reserch gate, 2015.
• [12]K. syou Kuroda Keiko, “Lisk of water outage and withering by trunk injection against pine-wilt disease,” 2016.
• [13]A. Fire, S. Xu, M. K. Montgomery, S. A. Kostas, S. E. Driver, and C. C. Mello, “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans,” Nature, vol. 391, no. 6669, pp. 806–811, Feb. 1998.