Team:Imperial College/Experiments
Methods
Contents
- Assembling the Pixcell Constructs
- Characterizing Pixcell Constructs
- Electrochemistry of Redox Modulators
- Spatial Electronic Control of Gene Induction
- Creating the Sox Library
- Characterising the Sox Library
- Testing Phenazine Methosulfate
- Biocontainment- Gp2 Growth Inhibition
- Fabric Bioprinting - Melanin
Experiments
Assembling the Pixcell Constructs
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Characterizing Pixcell Constructs
This protocol describes how to measure E. coli growth and GFP expression over time with a plate reader, using the optical density at 600 nm as signal for cell density and excitation and emission wavelengths of 475. All characterization was performed using the FLUOstar BMG Labtech in greiner bioone F-bottom dark plates with clear bottom, to decrease fluorescence background. Each cycle of this experiment takes two days and has to be repeated two days, in order to have 2 biological and 2 technical replicates, for a total of 4 days and 4 96-well plates used.
- Autoclaved LB media
- Autoclaved 10x concentated LB media
- 500 uM pyocyanin stock solution (from Sigma-Aldrich, CAS: No. 86-66-5)
- 1250 mM potassium ferricyanide stock solution (from Sigma-Aldrich, CAS: No. 13746-66-2)
- 500 mM ferrocyanide stock solution (from Sigma-Aldrich, CAS 14459-95-1 )
- 2% Sodium Sulfite Solution
- Agar plates with colonies of E. coli DJ901 strains with respective constructs: PixCell Patterning Circuit 1 (BBa_K2862021). PixCell Patterning Circuit 2 (BBa_K2862022), negative control (DJ901 WT) and positive control (constitutively expressed GFP).
- 37°C shaking incubator
- BMG Labtech FLUOstar plate reader
- 4x Greiner BioOne 96-F 96-well microplate (black with clear bottom)
- 14 mL culture tubes
- autoclaved eppendorfs
Work in very sterile conditions. To prevent contaminations in the blanks, use double antibiotics. Store pyocyanin and ferrocyanide and ferricyanide solutions in the freezer until use. We used 10x concentrated LB in order not to dilute nutrients at higher pyocyanin concentration; this was back diluted with autoclaved water.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
- Grow starter liquid cultures of cells (Day 0, 10-15 min preparation + overnight)
- Prepare mastermixes (30 min)
Working in very sterile conditions, take 5 14mL culture tubes and prepare them according to table below:
| Label | E. coli strain | Construct | Antibiotic (Ab) | V Ab (uL) | V LB (mL) |
|---|---|---|---|---|---|
| PC1 | DJ901 | BBa_K2862021 | Kan + Amp | 5 + 5 | 5 |
| PC2 | DJ901 | BBa_K2862022 | Kan + Amp | 5 + 5 | 5 |
| - | DJ901 | none | Kan | 5 | 5 |
| + | DJ901 | GFP_Boo | Kan + Chl | 5 + 5 | 5 |
| Blanks | None | None | Kan + Amp + Chl | 5 + 5 | 5 |
With a pipette tip pick a desired colony* from an agar plate and release the contaminated tip in the culture tip. Place inoculated culture tubes in a 37° C in a shaking incubator overnight (for faster growth the angle between the vertical axis of the tube and the shaking plane of the incubator should be of 45°)
Mastermixes for each redox molecule concentration are prepared in 1.5 mL eppendorfs. The mastermixes are enough to fill 2 96-well microplates with 100 uL of solutions in each well, in order to have two replicate of the same experiment. Take 8 autoclaved 1.5 mL eppendorfs and prepare them as described in the table below.
Mastermizes for Day 1 and Day 2 :
| Condition | V Pyo (uL) | Kan (uL) | LB 10x uL | Autoclaved Water (uL) | Tot Vol (uL) |
|---|---|---|---|---|---|
| A = 0 uM Pyo | 0 | 2.44 | 122 | 1098 | 1220 |
| B = 0.01 uM Pyo | 0.0976 | 2.44 | 122 | 1097.9024 | 1220 |
| C = 0.025 uM Pyo | 0.244 | 2.44 | 122 | 1097.756 | 1220 |
| D = 0.05 uM Pyo | 0.488 | 2.44 | 122 | 1097.512 | 1220 |
| E = 0.1 uM Pyo | 0.976 | 2.44 | 122 | 1097.024 | 1220 |
| F = 0.25 uM Pyo | 2.44 | 2.44 | 122 | 1095.56 | 1220 |
| G = 0.5 uM Pyo | 4.88 | 2.44 | 122 | 1093.12 | 1220 |
| H = 1 uM Pyo | 9.76 | 2.44 | 122 | 1088.24 | 1220 |
Mastermixes for Day 3 and Day 4
Electrochemistry of Redox Modulators
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Spatial Electronic Control of Gene Induction
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Creating the Sox Library
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Characterising the Sox Library
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Testing Phenazine Methosulfate
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Biocontainment- Gp2 Growth Inhibition
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Fabric Bioprinting - Melanin
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat. Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Competant cell protocol Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet Heatshock protocol consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
Lorem ipsum dolor, sit amet consectetur adipisicing elit. Recusandae dolore, tenetur expedita in architecto, repellat rerum minima cumque exercitationem debitis laborum fugit aliquam quo molestiae. Alias eius nostrum aspernatur quaerat.
