Difference between revisions of "Team:NCKU Tainan/Protocol"

Line 1: Line 1:
−
r: white !important;
+
{{NCKU_Tainan/header}} {{NCKU_Tainan/navbar}} {{NCKU_Tainan/style}}
 +
 
 +
<html>
 +
 
 +
<head>
 +
    <link rel="stylesheet" href="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/css/protocal?action=raw&ctype=text/css">
 +
</head>
 +
 
 +
<body>
 +
 
 +
    <!--Page_Content-->
 +
    <div class="container content">
 +
        <div class="navbar-example">
 +
            <div class="row">
 +
 
 +
                <div class="col-10">
 +
                    <div data-spy="scroll" data-target="#sidelist" data-offset="0" class="scrollspy-example">
 +
                        <div class="container">
 +
                            <h1 class="head2">Protocol</h1>
 +
                            <div id="list-item-1">
 +
                                </br>
 +
                                <div class="row">
 +
                                    <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#PCR" role="button"
 +
                                        aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
 +
                                        PCR
 +
                                        <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
 +
                                    </a>
 +
                                </div>
 +
 
 +
                                <div class="collapse multi-collapse" id="PCR">
 +
                                    <p class="pcontent"></br></br>1. Gently mix the following reaction by pipetting and
 +
                                        centrifuge briefly.</p>
 +
                                    <table class="card card-body">
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<th></th>
 +
                                            　<th>20 μl system</th>
 +
                                            <th>50 μl system</th>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>Template</td>
 +
                                            　<td>12～20 ng</td>
 +
                                            <td>30～50 ng</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>Forward primer</td>
 +
                                            　<td>1.0 μl</td>
 +
                                            <td>2.5 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>Reverse primer</td>
 +
                                            　<td>1.0 μl</td>
 +
                                            <td>2.5 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>dNTP</td>
 +
                                            　<td>1.6 μl</td>
 +
                                            <td>4.0 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>10x Buffer</td>
 +
                                            　<td>2.0 μl</td>
 +
                                            <td>5.0 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
                                    </table>
 +
                                    <p class="pcontent"></br>Program of KOD DNA polymerase</p>
 +
                                    <table class="card card-body">
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<th>Temperature</th>
 +
                                            　<th>Time</th>
 +
                                            <th></th>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>94 ℃</td>
 +
                                            　<td>3 min.</td>
 +
                                            <td rowspan="3">25～30 cycles</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>94 ℃</br>(Denaturation)</td>
 +
                                            　<td>40 sec</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>57.5 ℃</br>(Annealing)</td>
 +
                                            　<td>30 sec</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>72 ℃</br>(Extension)</td>
 +
                                            　<td>Depend on sequence size</br>(2 kbp/min. for Taq)</td>
 +
                                            <td></td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>72 ℃</td>
 +
                                            　<td>5 min.</td>
 +
                                            <td></td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>4 ℃</td>
 +
                                            　<td>∞</td>
 +
                                            <td></td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                    </table>
 +
                                    <p class="pcontent"></br>2. Confirm the size of the digested product by gel
 +
                                        electrophoresis.</br></br>
 +
                                        3. Gel purification of the target size.</br></br></p>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
                                </div>
 +
 
 +
                            </div>
 +
 
 +
                            <div id="list-item-2">
 +
 
 +
                                </br>
 +
                                <div class="row">
 +
                                    <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Plasmid_Construction" role="button"
 +
                                        aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
 +
                                        Plasmid Construction
 +
                                        <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
 +
                                    </a>
 +
                                </div>
 +
 
 +
                                <div class="collapse multi-collapse" id="Plasmid_Construction">
 +
                                    </br></br>
 +
                                    <p class="pcontent">1. Digestion (vector)</p>
 +
                                    <table class="card card-body">
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<th>Plasmid</th>
 +
                                            　<th>200 ng</th>
 +
                                            <th>1000 ng</th>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>EcoRI / SpeI</td>
 +
                                            　<td>0.2 μl</td>
 +
                                            <td>1 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>XbaI / PstI</td>
 +
                                            　<td>0.2 μl</td>
 +
                                            <td>1 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                            　<td>2 μl</td>
 +
                                            <td>5 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>ddH2O</td>
 +
                                            　<td>Up to 20 μl</td>
 +
                                            <td>Up to 50 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
 +
                                            　<td></td>
 +
                                            <td></td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                    </table>
 +
 
 +
                                    </br>
 +
                                    <p class="pcontent">2. Digestion (insert)</p>
 +
                                    <table class="card card-body">
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<th>Plasmid</th>
 +
                                            　<th>200 ng</th>
 +
                                            <th>1000 ng</th>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>EcoRI / XbaI</td>
 +
                                            　<td>0.2 μl</td>
 +
                                            <td>1 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>SpeI / PstI</td>
 +
                                            　<td>0.2 μl</td>
 +
                                            <td>1 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                            　<td>2 μl</td>
 +
                                            <td>5 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        　<tr>
 +
                                            　<td>ddH2O</td>
 +
                                            　<td>Up to 20 μl</td>
 +
                                            <td>Up to 50 μl</td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                        <tr>
 +
                                            　<td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
 +
                                            　<td></td>
 +
                                            <td></td>
 +
                                        </tr>
 +
 
 +
                                    </table>
 +
 
 +
                                    </br>
 +
                                    <p class="pcontent">3.Confirm the size of the digested product by gel
 +
                                        electrophoresis.</br></br>
 +
                                        4. Gel purification of the target size.</br></br>
 +
                                        5. Ligation</br>
 +
 
 +
                                        <table class="card card-body">
 +
 
 +
                                            　<tr>
 +
                                                　<td>Vector (2 kbp)</td>
 +
                                                　<td rowspan="2">molar ratio = 1:3</br>(can up to 1:10 depending on the
 +
                                                    DNA sizes)</td>
 +
                                            </tr>
 +
 
 +
                                            <tr>
 +
                                                　<td>Insert (1.5 kbp)</td>
 +
                                            </tr>
 +
 
 +
                                            <tr>
 +
                                                　<td>Quick Ligase Reaction Buffer (2X)*</td>
 +
                                                <td>10 μl</td>
 +
                                            </tr>
 +
 
 +
                                            <tr>
 +
                                                　<td>Quick Ligase</td>
 +
                                                <td>1 μl</td>
 +
                                            </tr>
 +
 
 +
                                            <tr>
 +
                                                　<td>ddH2O</td>
 +
                                                <td>Up to 20 μl</td>
 +
                                            </tr>
 +
 
 +
                                        </table>
 +
 
 +
                                        </br>
 +
                                        <p class="pcontent">6. Transform the product by heat shock.</br>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
                                </div>
 +
                            </div>
 +
 
 +
 
 +
                            <div id="list-item-3">
 +
                                </br>
 +
                                <div class="row">
 +
                                    <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Extraction" role="button"
 +
                                        aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
 +
                                        PCR Clean-Up & Gel Extraction
 +
                                        <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
 +
                                    </a>
 +
                                </div>
 +
 
 +
                                <div class="collapse multi-collapse" id="Extraction">
 +
 
 +
                                    </br></br>
 +
                                    <h3>Gel Dissociation</h3></br>
 +
                                    <p class="pcontent">1. Gel Extraction</br></br>
 +
                                        a. Excised the DNA fragment from the agarose gel.</br></br>
 +
                                        b. Transferred up to 300 mg of the gel slice to a 1.5 ml microcentrifuge tube.</br></br>
 +
                                        c. Added 500 μl of the Gel/PCR Bufffer to the sample and mixed by vortex.
 +
                                        Incubate
 +
                                        at 55~60℃ for 10 minutes (or until the gel slice has completely dissolved).</br></br>
 +
                                        d. During the incubation, mixed by vortexing the tube every 2~3 minutes.</br></br>
 +
                                        e. Cooled the dissolved sample mixture to the room temperature.</br></br>
 +
                                    </p>
 +
                                    <h3>DNA Binding</h3></br>
 +
                                    <p class="pcontent">2. Placed a PG Column in a Collection Tube. Apply the
 +
                                        supernatant to the PG
 +
                                        Column
 +
                                        by decanting or pipetting.</br></br>
 +
                                        3. Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</br></br>
 +
                                        4. Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same
 +
                                        collection
 +
                                        tube.</br></br></p>
 +
                                    <h3>Wash</h3></br>
 +
                                    <p class="pcontent">6. Added 400 μl of the Buffer W1 into the PG Column.</br></br>
 +
                                        7. Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</br></br>
 +
                                        8. Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same
 +
                                        collection
 +
                                        tube.</br></br>
 +
                                        9. Added 600 μl of the Buffer W2 (ethanol added) into the PG Column.</br></br>
 +
                                        10. Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</br></br>
 +
                                        11. Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same
 +
                                        collection tube.</br></br>
 +
                                        12. Centrifuged at 16,000 xg again for 2 minutes to remove the residual Buffer
 +
                                        W2.</br></br></p>
 +
                                    <h3>Elution</h3></br>
 +
                                    <p class="pcontent">13. To elute the DNA, placed the PG Column in a clean 1.5 ml
 +
                                        microcentrifuge
 +
                                        tube.</br></br>
 +
                                        14. Added 50 μl of the H2O (pH is between 7.0 and 8.5) to the center of each PG
 +
                                        Column, let it stand for at least 2 minutes, and centrifuge at 16,000 xg for 2
 +
                                        min.</br></br></p>
 +
                                    </p>
 +
 
 +
                                </div>
 +
 
 +
                            </div>
 +
                            </br>
 +
                            <div class="row">
 +
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Preparation" role="button"
 +
                                    aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
 +
                                    Competent Cell Preparation
 +
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
 +
                                </a>
 +
                            </div>
 +
 
 +
                            <div class="collapse multi-collapse" id="Preparation">
 +
                                <p class="pcontent"></br></br>･ For E. coli DH5α,BL21(DE3) and W3100(DE3) competent
 +
                                    cell</br></br>
 +
                                    1. Streak out wild type E. coli on a plate (LB plate without antibiotics) overnight
 +
                                    and pick one colony into 3 ml of media (LB) and grow overnight.</br></br>
 +
                                    2. Transfer 0.4 ml of starter culture into 40 ml of fresh LB and grow culture at 37
 +
                                    ℃.</br></br>
 +
                                    3. When the OD600 nm up to 0.35, put the cells on ice immediately.</br></br>
 +
                                    4. Spin the cells at 4℃for 10 minutes at 4000 rpm.</br></br>
 +
                                    5. Suspend the pellet on ice carefully with 16 ml chilly Transformation Buffer
 +
                                    1(TFB1)</br></br>
 +
                                    6. Leave nicely suspended bugs on ice for 10 minutes.</br></br>
 +
                                    7. Spin the cells at 4℃ for 10 min. at 4000 rpm.</br></br>
 +
                                    8. Suspend the pellet on ice with 1.6 ml of Transformation Buffer 2 (TFB2).</br></br>
 +
                                    9. Leave on immediately on ice for 30 minutes.</br></br>
 +
                                    10. Aliquot 100 μl into 1.5 ml centrifuge tubes and snap freeze immediately with
 +
                                    liquid nitrogen.</br></br>
 +
                                    11. Store the frozen cells in the -80℃ freezer.</br></br></p>
 +
 
 +
                            </div>
 +
 
 +
                            <div id="list-item-4">
 +
 
 +
                                </br>
 +
                                <div class="row">
 +
                                    <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Plasmid_Extraction" role="button"
 +
                                        aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
 +
                                        Plasmid Extraction
 +
                                        <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
 +
                                    </a>
 +
                                </div>
 +
 
 +
                                <div class="collapse multi-collapse" id="Plasmid_Extraction">
 +
                                    <p class="pcontent"></br></br>1. Transfer 1.4 ml of well-grown bacterial culture to
 +
                                        a centrifuge tube.</br></br>
 +
                                        2. Centrifuge the tube at 16,000 xg for 1 minute to pellet the cells and
 +
                                        discard the supernatant completely.</br></br>
 +
                                        3. Add 200 µl of FAPD1 Buffer (RNaseA added) to the cell pellet and resuspend
 +
                                        the cells completely by pipetting.</br></br>
 +
                                        ･ Make sure that RNaseA has been added into FAPD1 Buffer when first use.</br></br>
 +
                                        ･ No cell pellet should be visible after resuspension of the cells.</br></br>
 +
                                        4. Add 200 µl of FAPD2 Buffer and gently invert the tube 5 ~ 10 times. Incubate
 +
                                        the sample mixture at room temperature for 2 ~ 5 minutes to lyse the cells.</br></br>
 +
                                        ･ Do not vortex, vortex may shear genomic DNA. If necessary, continue inverting
 +
                                        the tube until the lysate become clear.</br></br> ･ Make sure the tube transfer
 +
                                        to clarify from turbid</br></br>
 +
                                        ･ Do not proceed with the incubation over 5 minutes.</br></br>
 +
                                        5. Add 300 µl of FAPD3 Buffer and invert the tube 5 ~ 10 times immediately to
 +
                                        neutralize the lysate.</br></br>
 +
                                        ･ Invert immediately after adding FAPD3 Buffer will avoid asymmetric
 +
                                        precipitation.</br></br>
 +
                                        6. Centrifuge at 16,000 xg for 3 minutess. to clarify the lysate. During
 +
                                        centrifugation, place a FAPD Column in a Collection Tube.</br></br>
 +
                                        7. Transfer the supernatant carefully to the FAPD Column and centrifuge at
 +
                                        16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place the column back to
 +
                                        the Collection Tube.</br></br>
 +
                                        ･ Do not transfer any white pellet into the column.</br></br>
 +
                                        8. Add 400 µl of W1 Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for 1
 +
                                        minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection
 +
                                        Tube.</br></br>
 +
                                        9. Add 600 µl of Wash Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for
 +
                                        1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection
 +
                                        Tube.</br></br>
 +
                                        ･ Make sure that ethanol (96 ~ 100 %) has been added into Wash Buffer when
 +
                                        first use.</br></br>
 +
                                        10. Centrifuge at 16,000 xg for an additional 3 minutes to dry the FAPD Column.</br></br>
 +
                                        ･ Important step! The residual liquid should be removed thoroughly on this
 +
                                        step.</br></br>
 +
                                        11. Place the FAPD Column to a new 1.5 ml microcentrifuge tube.</br></br>
 +
                                        12. Add 30 µl of Elution Buffer or ddH2O to the membrane center of the FAPD
 +
                                        Column. Stand the column for 3 minute.</br></br>
 +
                                        ･ Important step! For effective elution, make sure that the elution solution is
 +
                                        dispensed on the membrane center and is absorbed completely.</br></br>
 +
                                        ･ Do not elute the DNA using less than suggested volume (50 µl). It will lower
 +
                                        the final yield.</br></br>
 +
                                        13. Centrifuge at 16,000 xg for 3 minute to elute plasmid DNA and store the DNA
 +
                                        at -20 ℃.</br></br></p>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
                                </div>
 +
                            </div>
 +
 
 +
                        </div>
 +
 
 +
 
 +
                    </div>
 +
                </div>
 +
            </div>
 +
        </div>
 +
    </div>
 +
 
 +
    <style>
 +
        .head2 {
 +
            color: white;
 +
            width: 26%;
 +
            font-size: 50px;
 +
            /* font-weight: 700; */
 +
            border-bottom: 10px solid #7ae26f !important;
 +
            position: relative;
 +
        }
 +
 
 +
        /* paragraph content*/
 +
        h10 {
 +
            color: white;
 +
            font-size: 1.4rem;
 +
            line-height: 150%;
 +
        }
 +
 
 +
        body {
 +
            background-color: #272625;
 +
        }
 +
 
 +
 
 +
        p {
 +
            color: white;
 +
            font-size: 20px;
 +
        }
 +
 
 +
        h3 {
 +
            color: white;
 +
            font-size: 35px;
 +
        }
 +
 
 +
        .navbar {
 +
            padding-top: 10px;
 +
            margin-bottom: 0;
 +
        }
 +
 
 +
        .navbar-brand {
 +
            font-size: 30px;
 +
        }
 +
 
 +
        .nav-link {
 +
            font-size: 20px;
 +
        }
 +
 
 +
        a.dropdown-item {
 +
            color: #4F7F52;
 +
        }
 +
 
 +
        a.dropdown-item:active {
 +
            background-color: #4F7F52;
 +
        }
 +
 
 +
        .caret {
 +
            display: inline-block;
 +
            width: 0;
 +
            height: 0;
 +
            margin-left: 2px;
 +
            vertical-align: middle;
 +
            border-top: 4px solid;
 +
            border-right: 4px solid transparent;
 +
            border-left: 4px solid transparent;
 +
        }
 +
 
 +
        /*滑到navbar就展開*/
 +
        .dropdown-menu li:hover .sub-menu {
 +
            visibility: visible;
 +
        }
 +
 
 +
        .dropdown:hover .dropdown-menu {
 +
            display: block;
 +
        }
 +
 
 +
        .head {
 +
            color: white;
 +
            width: 50%;
 +
            font-size: 50px;
 +
            font-weight: 700;
 +
            border-bottom: 10px solid #7ae26f;
 +
            position: relative;
 +
            margin-top: 100px;
 +
        }
 +
 
 +
        .container.content {
 +
            margin-top: 80px;
 +
        }
 +
 
 +
        @media (min-width: 992px) {
 +
            .navbar {
 +
                padding-left: 80px;
 +
                padding-right: 80px;
 +
            }
 +
        }
 +
 
 +
        @media (max-width: 768px) {
 +
            .navbar-right form {
 +
                display: none;
 +
            }
 +
        }
 +
 
 +
        @media (max-width: 568px) {
 +
            footer {
 +
                text-align: center;
 +
            }
 +
 
 +
            .list-group {
 +
                display: none;
 +
            }
 +
        }
 +
 
 +
        /*folded-corner*/
 +
        .post {
 +
            position: relative;
 +
        }
 +
 
 +
        .folded-corner {
 +
            position: absolute;
 +
            bottom: 0px;
 +
            right: 0px;
 +
            border-width: 0;
 +
            border-style: solid;
 +
            background: hsla(260, 100%, 100%, 0.2);
 +
            box-shadow: 0px -4px 0px rgba(0, 0, 0, 0.3), -1px -4px 0px rgba(0, 0, 0, 0.1);
 +
            border-radius: 15px 0 0 0;
 +
            border-color: transparent #B9DEBB transparent transparent;
 +
            transition: border-width 0.2s ease-out;
 +
        }
 +
 
 +
        .post:hover .folded-corner {
 +
            border-width: 40px 40px 0 0;
 +
        }
 +
 
 +
        .photo .folded-corner {
 +
            background: hsla(260, 5%, 75%, 0.5);
 +
        }
 +
 
 +
        [class*="col-"] {
 +
            float: left;
 +
            padding: 13px;
 +
        }
 +
 
 +
        a.list-group-item:visited {
 +
            color: white;
 +
        }
 +
 
 +
        a:hover {
 +
            background-color: transparent;
 +
        }
 +
 
 +
        .list-group {
 +
            margin-top: 100px;
 +
        }
 +
 
 +
        .col-2.side {
 +
            padding: 0;
 +
        }
 +
 
 +
        .list-group-item {
 +
            padding: .55rem .35rem;
 +
            background-color: #272625;
 +
            color: white;
 +
            border: none;
 +
            font-size: 19px;
 +
        }
 +
 
 +
        a.list-group-item.list-group-item-action {
 +
            background-color: transparent;
 +
        }
 +
 
 +
        a.list-group-item.list-group-item-action:hover {
 +
            color: #98CC9B;
 +
        }
 +
 
 +
        a.list-group-item.list-group-item-action.active {
 +
            background-color: transparent;
 +
            color: #7ae26f;
 +
        }
 +
 
 +
        .scrollspy-example h4 {
 +
            font-size: 2rem;
 +
        }
 +
 
 +
 
 +
 
 +
        img.contentimg {
 +
            width: 100%;
 +
            margin: 20px 0;
 +
        }
 +
 
 +
        a.link {
 +
            font-size: 30px;
 +
            color: #4F7F52;
 +
        }
 +
 
 +
        #list-item-1 {
 +
            padding-top: 0px;
 +
        }
 +
 
 +
        #list-item-2 {
 +
            padding-top: 0px;
 +
        }
 +
 
 +
        #list-item-3 {
 +
            padding-top: 0px;
 +
        }
 +
 
 +
        #list-item-4 {
 +
            padding-top: 0px;
 +
        }
 +
 
 +
        #list-item-5 {
 +
            padding-top: 0px;
 +
        }
 +
 
 +
        a.reference {
 +
            color: #4F7F52;
 +
        }
 +
 
 +
        .btn {
 +
            background-color: #98CC9B;
 +
            color: #272625;
 +
            border: none;
 +
            font-size: 1.5rem;
 +
        }
 +
 
 +
        .btn:hover {
 +
            color: white;
 +
            background-color: transparent;
 +
            border-color: transparent;
 +
            border-bottom: 3px;
 +
            border-bottom-color: #98CC9B;
 +
            border-bottom-style: solid;
 +
            border-radius: 0rem;
 +
        }
 +
 
 +
        .btn.focus,
 +
        .btn:focus {
 +
            box-shadow: none;
 +
        }
 +
 
 +
        td {
 +
            text-align: center;
 +
            color: black !important;
 +
            border: 2px solid black !important;
 +
            background-color: white !important;
 
         }
 
         }
  

Revision as of 16:01, 21 September 2018

Protocol




1. Gently mix the following reaction by pipetting and centrifuge briefly.

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
20 μl system 50 μl system
Template12～20 ng 30～50 ng
Forward primer1.0 μl 2.5 μl
Reverse primer1.0 μl 2.5 μl
dNTP1.6 μl 4.0 μl
10x Buffer2.0 μl 5.0 μl


Program of KOD DNA polymerase

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
TemperatureTime
94 ℃3 min. 25～30 cycles
94 ℃
(Denaturation)		40 sec
57.5 ℃
(Annealing)		30 sec
72 ℃
(Extension)		Depend on sequence size
(2 kbp/min. for Taq)
72 ℃5 min.
4 ℃∞


2. Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.

3. Gel purification of the target size.




1. Digestion (vector)

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Plasmid200 ng 1000 ng
EcoRI / SpeI0.2 μl 1 μl
XbaI / PstI0.2 μl 1 μl
CutSmart Buffer2 μl 5 μl
ddH2OUp to 20 μl Up to 50 μl
Digestion at 37℃ for 2.5hr.

2. Digestion (insert)

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Plasmid200 ng 1000 ng
EcoRI / XbaI0.2 μl 1 μl
SpeI / PstI0.2 μl 1 μl
CutSmart Buffer2 μl 5 μl
ddH2OUp to 20 μl Up to 50 μl
Digestion at 37℃ for 2.5hr.

3.Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.

4. Gel purification of the target size.

5. Ligation

　 　 　 　 　 　 　
Vector (2 kbp)molar ratio = 1:3
(can up to 1:10 depending on the DNA sizes)
Insert (1.5 kbp)
Quick Ligase Reaction Buffer (2X)* 10 μl
Quick Ligase 1 μl
ddH2O Up to 20 μl

6. Transform the product by heat shock.




Gel Dissociation


1. Gel Extraction

a. Excised the DNA fragment from the agarose gel.

b. Transferred up to 300 mg of the gel slice to a 1.5 ml microcentrifuge tube.

c. Added 500 μl of the Gel/PCR Bufffer to the sample and mixed by vortex. Incubate at 55~60℃ for 10 minutes (or until the gel slice has completely dissolved).

d. During the incubation, mixed by vortexing the tube every 2~3 minutes.

e. Cooled the dissolved sample mixture to the room temperature.

DNA Binding


2. Placed a PG Column in a Collection Tube. Apply the supernatant to the PG Column by decanting or pipetting.

3. Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.

4. Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.

Wash


6. Added 400 μl of the Buffer W1 into the PG Column.

7. Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.

8. Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.

9. Added 600 μl of the Buffer W2 (ethanol added) into the PG Column.

10. Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.

11. Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.

12. Centrifuged at 16,000 xg again for 2 minutes to remove the residual Buffer W2.

Elution


13. To elute the DNA, placed the PG Column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.

14. Added 50 μl of the H2O (pH is between 7.0 and 8.5) to the center of each PG Column, let it stand for at least 2 minutes, and centrifuge at 16,000 xg for 2 min.




･ For E. coli DH5α,BL21(DE3) and W3100(DE3) competent cell

1. Streak out wild type E. coli on a plate (LB plate without antibiotics) overnight and pick one colony into 3 ml of media (LB) and grow overnight.

2. Transfer 0.4 ml of starter culture into 40 ml of fresh LB and grow culture at 37 ℃.

3. When the OD600 nm up to 0.35, put the cells on ice immediately.

4. Spin the cells at 4℃for 10 minutes at 4000 rpm.

5. Suspend the pellet on ice carefully with 16 ml chilly Transformation Buffer 1(TFB1)

6. Leave nicely suspended bugs on ice for 10 minutes.

7. Spin the cells at 4℃ for 10 min. at 4000 rpm.

8. Suspend the pellet on ice with 1.6 ml of Transformation Buffer 2 (TFB2).

9. Leave on immediately on ice for 30 minutes.

10. Aliquot 100 μl into 1.5 ml centrifuge tubes and snap freeze immediately with liquid nitrogen.

11. Store the frozen cells in the -80℃ freezer.




1. Transfer 1.4 ml of well-grown bacterial culture to a centrifuge tube.

2. Centrifuge the tube at 16,000 xg for 1 minute to pellet the cells and discard the supernatant completely.

3. Add 200 µl of FAPD1 Buffer (RNaseA added) to the cell pellet and resuspend the cells completely by pipetting.

･ Make sure that RNaseA has been added into FAPD1 Buffer when first use.

･ No cell pellet should be visible after resuspension of the cells.

4. Add 200 µl of FAPD2 Buffer and gently invert the tube 5 ~ 10 times. Incubate the sample mixture at room temperature for 2 ~ 5 minutes to lyse the cells.

･ Do not vortex, vortex may shear genomic DNA. If necessary, continue inverting the tube until the lysate become clear.

･ Make sure the tube transfer to clarify from turbid

･ Do not proceed with the incubation over 5 minutes.

5. Add 300 µl of FAPD3 Buffer and invert the tube 5 ~ 10 times immediately to neutralize the lysate.

･ Invert immediately after adding FAPD3 Buffer will avoid asymmetric precipitation.

6. Centrifuge at 16,000 xg for 3 minutess. to clarify the lysate. During centrifugation, place a FAPD Column in a Collection Tube.

7. Transfer the supernatant carefully to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.

･ Do not transfer any white pellet into the column.

8. Add 400 µl of W1 Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.

9. Add 600 µl of Wash Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.

･ Make sure that ethanol (96 ~ 100 %) has been added into Wash Buffer when first use.

10. Centrifuge at 16,000 xg for an additional 3 minutes to dry the FAPD Column.

･ Important step! The residual liquid should be removed thoroughly on this step.

11. Place the FAPD Column to a new 1.5 ml microcentrifuge tube.

12. Add 30 µl of Elution Buffer or ddH2O to the membrane center of the FAPD Column. Stand the column for 3 minute.

･ Important step! For effective elution, make sure that the elution solution is dispensed on the membrane center and is absorbed completely.

･ Do not elute the DNA using less than suggested volume (50 µl). It will lower the final yield.

13. Centrifuge at 16,000 xg for 3 minute to elute plasmid DNA and store the DNA at -20 ℃.