Difference between revisions of "Team:NCKU Tainan/Protocol"

 
(37 intermediate revisions by 4 users not shown)
Line 3: Line 3:
 
<html>
 
<html>
  
    <head>
+
<head>
        <link rel="stylesheet" href="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/css/protocol_style?action=raw&ctype=text/css">
+
    <link rel="stylesheet" href="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/css/protocol_style?action=raw&ctype=text/css">
    </head>
+
</head>
  
    <body data-spy="scroll" data-target=".navbar-example">
+
<body data-spy="scroll" data-target=".navbar-example">
        <div class="container content">
+
    <div class="container content">
 +
        <div class="headstyle">
 
             <h1 class="head">Protocol</h1>
 
             <h1 class="head">Protocol</h1>
             <div class="navbar-example">
+
        </div>
                <div class="row">
+
        <div class="righttitle">
                    <div class="col-12">
+
             <h6 class="subtitle">Read </h6>
                        <div data-spy="scroll" data-target="#sidelist" data-offset="0" class="scrollspy-example">
+
        </div>
                            <div class="container">
+
        <div class="navbar-example">
                                <div class="row">  
+
            <div class="row">
                                    <div class="card-deck">
+
                <div class="col-12">
                                        <div class="card col-4">
+
                    <div data-spy="scroll" data-target="#sidelist" data-offset="0" class="scrollspy-example">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#PCR">
+
                        <div class="container">
                                                <div class="post">
+
                            <div class="row">
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                <div class="card-deck">
                                                    <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/0/01/T--NCKU_Tainan--protocol_PCR.jpg" alt="PCR">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                </div>
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                <div class="card-body">
+
                                            data-target="#Dry_cell_weight">
                                                     <h5 class="card-title">PCR</h5>
+
                                            <div class="post">
                                                </div>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/1f/T--NCKU_Tainan--protocol_Dry_cell_weight.jpg"
 +
                                                     alt="Dry cell weight">
 
                                             </div>
 
                                             </div>
                                        </div>
+
                                             <div class="card-body">
                                        <div class="modal" id="PCR" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                                 <h5 class="card-title">Dry Cell Weight</h5>
                                             <div class="modal-dialog" role="document">
+
                                                 <div class="modal-content">
+
                                                    <div class="modal-header">PCR
+
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                                        </button>
+
                                                    </div>
+
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                        <ol>
+
                                                            <li>Gently mix the following reaction by pipetting and centrifuge briefly.</li>
+
                                                            <table class="centertable">
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <th></th>
+
                                                                    <th>20 μl system</th>
+
                                                                    <th>50 μl system</th>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Template</td>
+
                                                                    <td>12~20 ng</td>
+
                                                                    <td>30~50 ng</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Forward primer</td>
+
                                                                    <td>1.0 μl</td>
+
                                                                    <td>2.5 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Reverse primer</td>
+
                                                                    <td>1.0 μl</td>
+
                                                                    <td>2.5 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>dNTP</td>
+
                                                                    <td>1.6 μl</td>
+
                                                                    <td>4.0 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>10x Buffer</td>
+
                                                                    <td>2.0 μl</td>
+
                                                                    <td>5.0 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                            </table>
+
                                                            <p>Program of KOD DNA polymerase</p>
+
                                                            <table class="centertable">
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <th>Temperature</th>
+
                                                                    <th>Time</th>
+
                                                                    <th>Repeat</th>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>94 ℃</td>
+
                                                                    <td>3 min.</td>
+
                                                                    <td></td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>94 ℃</br>(Denaturation)</td>
+
                                                                    <td>40 sec</td>
+
                                                                    <td rowspan="3">25~30 cycles</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>57.5 ℃</br>(Annealing)</td>
+
                                                                    <td>30 sec</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>72 ℃</br>(Extension)</td>
+
                                                                    <td>Depend on sequence size</br>(2 kbp/min. for Taq)</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>72 ℃</td>
+
                                                                    <td>5 min.</td>
+
                                                                    <td></td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>4 ℃</td>
+
                                                                    <td>∞</td>
+
                                                                    <td></td>
+
                                                                </tr>
+
                                                            </table>
+
                                                            <li>Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.</li>
+
                                                            <li>Gel purification of the target size.</li>
+
                                                        </ol>
+
                                                    </div>
+
                                                    <div class="modal-footer">
+
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    </div>
+
                                                </div>
+
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                       
+
                                    </div>
                                        <div class="card col-4">
+
                                    <div class="modal" id="Dry_cell_weight" tabindex="-1" role="dialog">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Plasmid_Construction">
+
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
                                                <div class="post">
+
                                            <div class="modal-content">
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                                <div class="modal-header">Dry Cell Weight
                                                     <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/4/41/T--NCKU_Tainan--protocol_plasmid.jpg" alt="Plasmid Construction">
+
                                                     <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
                                                 <div class="card-body">
+
                                                 <div class="modal-body">
                                                     <h5 class="card-title">Plasmid Construction</h5>
+
                                                     <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Preculture the bacteria overnight in 4ml
 +
                                                            LB with selective antibiotic.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Refresh the precultured bacteria in 20 ml
 +
                                                            of M9 xylose in flask. </li>
 +
                                                        <li class="licontent">Culture the bacteria for 24 hr in normal
 +
                                                            incubator with 177 rpm and 37℃ condition in 24 hr.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the optical density of the sample
 +
                                                            with 600 nm light wavelength, and then diluted the optical
 +
                                                            density value to 0.25 ,0.5, 0.75, 1 in 4ml of bacteria
 +
                                                            respectively.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the weight of an empty eppendorf.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Transfer 4 ml of bacteria to eppendorf,
 +
                                                            and then centrifuge them at 16000xg for 3 min.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Put the eppendorfs in the 60℃
 +
                                                            high-temperature oven with cap opened for 12 hr.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the net weight of the bacteria
 +
                                                            after 12 hr.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Analyze the dry cell weight and draw the
 +
                                                            regression line of it.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                        <div class="modal" id="Plasmid_Construction" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
 
                                                <div class="modal-content">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    <div class="modal-header">Plasmid Construction
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                            data-target="#Minimal_Salts_Medium_Xylose_Preparation">
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                            <div class="post">
                                                        </button>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                    </div>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/4/4f/T--NCKU_Tainan--protocol_M9_Medium_Xylose_Preparation.jpg"
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                    alt="assay">
                                                        <div id="Plasmid_Construction">
+
                                            </div>
                                                            <ol>
+
                                            <div class="card-body">
                                                                <li>Digestion (vector)</li>
+
                                                <h5 class="card-title">Minimal Salts (M9) Medium Xylose Preparation</h5>
                                                            </ol>
+
                                                            <table class="centertable">
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <th>Plasmid</th>
+
                                                                   <th>200 ng</th>
+
                                                                    <th>1000 ng</th>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>EcoRI-HF</td>
+
                                                                    <td>0.2 μl</td>
+
                                                                    <td>1 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>SpeI-HF</td>
+
                                                                    <td>0.2 μl</td>
+
                                                                    <td>1 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>CutSmart Buffer</td>
+
                                                                    <td>2 μl</td>
+
                                                                    <td>5 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
+
                                                                    <td>Up to 20 μl</td>
+
                                                                    <td>Up to 50 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
+
                                                                    <td></td>
+
                                                                    <td></td>
+
                                                                </tr>
+
                                                            </table>
+
                                                            <ol start="2">
+
                                                                <li>Digestion (insert)</li>
+
                                                            </ol>
+
                                                            <table class="centertable">
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <th>Plasmid</th>
+
                                                                    <th>200 ng</th>
+
                                                                    <th>1000 ng</th>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>EcoRI-HF</td>
+
                                                                    <td>0.2 μl</td>
+
                                                                    <td>1 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>XbaI</td>
+
                                                                    <td>0.2 μl</td>
+
                                                                    <td>1 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>CutSmart Buffer</td>
+
                                                                    <td>2 μl</td>
+
                                                                    <td>5 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
+
                                                                    <td>Up to 20 μl</td>
+
                                                                    <td>Up to 50 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
+
                                                                    <td></td>
+
                                                                    <td></td>
+
                                                                </tr>
+
                                                            </table>
+
                                                            <ol start="3">
+
                                                                <li>Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.</li>
+
                                                                <li>Gel purification of the target size.</li>
+
                                                                <li>Ligation</li>
+
                                                            </ol>
+
                                                            <table class="centertable">
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <th>Ingredient</th>
+
                                                                    <th>Volume</th>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Vector (2 kbp)</td>
+
                                                                    <td rowspan="2">molar ratio = 1:3</br>(can be up to 1:10, depends on the sizes of DNA)</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Insert (1.5 kbp)</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Quick Ligase Reaction Buffer (2X)*</td>
+
                                                                    <td>10 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>Quick Ligase</td>
+
                                                                    <td>1 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                                <tr>
+
                                                                    <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
+
                                                                    <td>Up to 20 μl</td>
+
                                                                </tr>
+
                                                            </table>
+
                                                            <ol start="6">
+
                                                                <li>Transform the product by heat shock.</li>
+
                                                            </ol>
+
                                                        </div>
+
                                                    </div>
+
                                                    <div class="modal-footer">
+
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    </div>
+
                                                </div>
+
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="Minimal_Salts_Medium_Xylose_Preparation" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">Minimal Salts (M9) Medium Xylose Preparation
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <p class="blackp">
 +
                                                        M9 medium contains essential salts and nitrogen.
 +
                                                        It contains 33.9 g/L Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O,
 +
                                                        15 g/L KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, 5 g/L NH<sub>4</sub>Cl and
 +
                                                        2.5 g/L NaCl;
 +
                                                        suitable for recombinant <i>E. coli</i> strains
 +
                                                    </p>
 +
                                                    <ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Minimal salts (M9) medium is suitable for
 +
                                                            non-selective cultivation of <i>E. coli</i> strains for
 +
                                                            cloning,
 +
                                                            production of DNA, plasmid DNA and recombinant proteins.
 +
                                                        </li>
 +
                                                        <li class="licontent">Suitable for selective cultivation when
 +
                                                            appropriate antibiotics are added.</li>
 +
                                                    </ul>
 +
                                                    <table class="centertable">
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <th>Substances</th>
 +
                                                            <th></th>
 +
                                                            <th>Volume in ml</th>
 +
                                                            <th>Volume(M)</th>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td colspan="2">M9 salt solution (10X)</td>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td>Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub></td>
 +
                                                            <td rowspan="4">100</td>
 +
                                                            <td>33.7 mM</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td>KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub></td>
 +
                                                            <td>22.0 mM</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td>NH<sub>4</sub>Cl</td>
 +
                                                            <td>9.35 mM</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td>NaCl</td>
 +
                                                            <td>8.55 mM</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>20% xylose</td>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td>20</td>
 +
                                                            <td>0.4 %</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>1 M MgSO<sub>4</sub></td>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td>1</td>
 +
                                                            <td>1 mM</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>1 M CaCl<sub>2</sub></td>
 +
                                                            <td></td>
 +
                                                            <td>0.3</td>
 +
                                                            <td>0.3 mM</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <!--tr>
 +
                                                                <td>biotin (1 mg/ml)</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                                <td>1</td>
 +
                                                                <td>1 µg</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>thiamin (1 mg/ml)</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                                <td>1</td>
 +
                                                                <td>1 µg</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>trace elements solution (100X)</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                                <td>1</td>
 +
                                                                <td>1X</td>
 +
                                                            </tr-->
 +
                                                    </table>
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">M9 salt solution (10X)</li>
 +
                                                        <p class="blackp">Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
 +
                                                            75.2 g/L</p>
 +
                                                        <p class="blackp">KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 30 g/L</p>
 +
                                                        <p class="blackp">NaCl 5 g/L</p>
 +
                                                        <p class="blackp">NH<sub>4</sub>Cl 5 g/L</p>
 +
                                                        <p class="blackp">- Dissolve the salts in 800 ml water</p>
 +
                                                        <p class="blackp">- Add water to a final volume of 1 L</p>
 +
                                                        <p class="blackp">- Autoclave for 15 min at 121°C</p>
  
                                        <div class="card col-4">
+
                                                        <li class="licontent">20% Xylose</li>
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#PCR_Clean_Up">
+
                                                        <p class="blackp">- Add 100 g xylose to 440 ml water</p>
                                                <div class="post">
+
                                                        <p class="blackp">- Add water to final volume 500ml</p>
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                                        <p class="blackp">- Autoclave for 15 min at 121°C</p>
                                                    <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/3/34/T--NCKU_Tainan--protocol_PCR_cleanup.jpg" alt="Clean Up">
+
 
 +
                                                        <li class="licontent">1 M MgSO<sub>4</sub></li>
 +
                                                        <p class="blackp">- Dissolve 24.65 g MgSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O
 +
                                                            in 87 ml water</p>
 +
                                                        <p class="blackp">- Add water to final volume 100ml</p>
 +
                                                        <p class="blackp">- Autoclave for 15 min at 121°C</p>
 +
 
 +
                                                        <li class="licontent">1 M CaCl<sub>2</sub></li>
 +
                                                        <p class="blackp">- Dissolve 14.70 g CaCl<sub>2</sub>-2H<sub>2</sub>O
 +
                                                            in 94.5 ml water</p>
 +
                                                        <p class="blackp">- Autoclave for 15 min at 121°C</p>
 +
 
 +
                                                        <!--li class="licontent">Biotin (1 mg/ml)</li>
 +
                                                            <p class="blackp">- Dissolve 50 mg biotin in 45 ml water</p>
 +
                                                            <p class="blackp">- Add small aliquots of 1N NaOH until the biotin has dissolved</p>
 +
                                                            <p class="blackp">- Add water to final volume 50ml</p>
 +
                                                            <p class="blackp">- Sterilize the solution over a 0.22-µM filter</p>
 +
                                                            <p class="blackp">- Prepare 1 ml aliquots and store at -20°C</p>
 +
 
 +
                                                            <li class="licontent">Thiamin (1 mg/ml)</li>
 +
                                                            <p class="blackp">- Dissolve 50 mg thiamin-HCl in 45 ml water</p>
 +
                                                            <p class="blackp">- Add water to a final volume of 50 ml</p>
 +
                                                            <p class="blackp">- Sterilize the solution over a 0.22-µm filter</p>
 +
                                                            <p class="blackp">- Prepare 1 ml aliquots and store at -20°C</p>
 +
 
 +
                                                            <li class="licontent">100X trace elements solution</li>
 +
                                                            <p class="blackp">498 mg FeCl<sub>3</sub> (anhydrous)</p>
 +
                                                            <p class="blackp">84 mg ZnCl<sub>2</sub></p>
 +
                                                            <p class="blackp">765 µl 0.1 M CuCl<sub>2</sub>-2H<sub>2</sub>O 1.70 g/100 ml</p>
 +
                                                            <p class="blackp">210 µl 0.2 M CoCl<sub>2</sub>-6H<sub>2</sub>O 4.76 g/100 ml</p>
 +
                                                            <p class="blackp">1.6 ml 0.1 M H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.62 g/100 ml</p>
 +
                                                            <p class="blackp">8.1 µl 1 M MnCl<sub>2</sub>-4H<sub>2</sub>O 19.8 g/100 ml</p-->
 +
                                                    </ol>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
                                                 <div class="card-body">
+
                                                 <div class="modal-footer">
                                                     <h5 class="card-title">PCR Clean-Up & Gel Extraction</h5>
+
                                                     <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                        <div class="modal" id="PCR_Clean_Up" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
 
                                                <div class="modal-content">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    <div class="modal-header">PCR Clean-Up & Gel Extraction
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                            data-target="#PRK_Toxicity_Test">
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                            <div class="post">
                                                        </button>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                    </div>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/d/d9/T--NCKU_Tainan--protocol_PRK_Toxicity_Test.jpg"
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                    alt="Total solution">
                                                        <ol>
+
                                            </div>
                                                            <li>Gel Extraction</li>
+
                                            <div class="card-body">
                                                            <ol>
+
                                                <h5 class="card-title">PRK Toxicity Test</h5>
                                                                <li>Excised the DNA fragment from the agarose gel.</li>
+
                                                                <li>Transferred up to 300 mg of the gel slice to a 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
+
                                                                <li>Added 500 μl of the Gel/PCR Bufffer to the sample and mixed by vortex.</li>
+
                                                                <li>Incubate at 55~60℃ for 10 minutes (or until the gel slice has completely dissolved).</li>
+
                                                                <li>During the incubation, mixed by vortexing the tube every 2~3 minutes.</li>
+
                                                                <li>Cooled the dissolved sample mixture to the room temperature.</li>
+
                                                            </ol>
+
                                                        </ol>
+
                                                        <h3>DNA Binding</h3>
+
                                                        <ol start="2">
+
                                                            <li>Placed a PG Column in a Collection Tube. Apply the supernatant to the PG Column by decanting or pipetting.</li>
+
                                                            <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
+
                                                            <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.</li>
+
                                                        </ol>
+
                                                        <h3>Wash</h3>
+
                                                        <ol start="5">
+
                                                            <li>Added 400 μl of the Buffer W1 into the PG Column.</li>
+
                                                            <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
+
                                                            <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.</li>
+
                                                            <li>Added 600 μl of the Buffer W2 (ethanol added) into the PG Column.</li>
+
                                                            <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
+
                                                            <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.</li>
+
                                                            <li>Centrifuged at 16,000 xg again for 2 minutes to remove the residual Buffer W2.</li>
+
                                                        </ol>
+
                                                        <h3>Elution</h3>
+
                                                        <ol start="12">
+
                                                            <li>To elute the DNA, placed the PG Column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
+
                                                            <li>Added 50 μl of the H2O (pH is between 7.0 and 8.5) to the center of each PG
+
                                                                Column, let it stand for at least 2 minutes, and centrifuge at 16,000 xg for 2 min.
+
                                                            </li>
+
                                                        </ol>
+
                                                    </div>
+
                                                    <div class="modal-footer">
+
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    </div>
+
                                                </div>
+
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                     </div>
+
                                     </div>
                                </div>
+
                                    <div class="modal" id="PRK_Toxicity_Test" tabindex="-1" role="dialog">
 
+
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
                                <div class="row">
+
                                            <div class="modal-content">
                                    <div class="card-deck">
+
                                                <div class="modal-header">PRK Toxicity Test
                                        <div class="card col-4">
+
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Plasmid_Extraction">
+
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
                                                <div class="post">
+
                                                     </button>
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                                     <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/1a/T--NCKU_Tainan--protocol_extraction.jpg" alt="Extraction">
+
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
                                                 <div class="card-body">
+
                                                 <div class="modal-body">
                                                     <h5 class="card-title">Plasmid Extraction</h5>
+
                                                     <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Preculture the bacteria overnight in 4ml
 +
                                                            LB with antibiotic.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Refresh the precultured bacteria in 4ml
 +
                                                            of M9 xylose in test tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Culture in the normal incubator for 12 hr
 +
                                                            with 177 rpm</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the optical density of the sample
 +
                                                            with 600 nm light wavelength at the beginning (0 hr) , and
 +
                                                            also measure them after 12 hr. All samples should be
 +
                                                            measured in triplicate.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                        <div class="modal" id="Plasmid_Extraction" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
                                </div>
                                                <div class="modal-content">
+
                            </div>
                                                    <div class="modal-header">Plasmid Extraction
+
 
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                            <div class="row">
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                <div class="card-deck">
                                                        </button>
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    </div>
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                    <div class="modal-body">
+
                                            data-target="#DNS_Reductive_Sugar_Measurement">
                                                        <ol>
+
                                            <div class="post">
                                                            <li>Transfer 1.4 ml of well-grown bacterial culture to a centrifuge tube.</li>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                            <li>Centrifuge the tube at 16,000 xg for 1 minute to pellet the cells and
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/9/99/T--NCKU_Tainan--protocol_DNS.jpg"
                                                                discard the supernatant completely.</li>
+
                                                    alt="DNS">
                                                            <li>Add 200 µl of FAPD1 Buffer (RNaseA added) to the cell pellet and resuspend
+
                                            </div>
                                                                the cells completely by pipetting.</li>
+
                                            <div class="card-body">
                                                            <ul>
+
                                                <h5 class="card-title">DNS Reductive Sugar Measurement</h5>
                                                                <li>Make sure that RNaseA has been added into FAPD1 Buffer when first use.</li>
+
                                                                <li>No cell pellet should be visible after resuspension of the cells.</li>
+
                                                            </ul>
+
                                                            <li>Add 200 µl of FAPD2 Buffer and gently invert the tube 5 ~ 10 times.
+
                                                                Incubate the sample mixture at room temperature for 2 ~ 5 minutes to lyse the cells.
+
                                                            </li>
+
                                                            <ul>
+
                                                                <li>Do not vortex, vortex may shear genomic DNA. If necessary, continue
+
                                                                    inverting the tube until the lysate become clear.</li>
+
                                                                <li>Make sure the tube transfer to clarify from turbid.</li>
+
                                                                <li>Do not proceed with the incubation over 5 minutes.</li>
+
                                                            </ul>
+
                                                            <li>Add 300 µl of FAPD3 Buffer and invert the tube 5 ~ 10 times immediately to neutralize the lysate.</li>
+
                                                            <ul>
+
                                                                <li>Invert immediately after adding FAPD3 Buffer will avoid asymmetric precipitation.</li>
+
                                                            </ul>
+
                                                            <li>Centrifuge at 16,000 xg for 3 minutess. to clarify the lysate. During
+
                                                                centrifugation, place a FAPD Column in a Collection Tube.</li>
+
                                                            <li>Transfer the supernatant carefully to the FAPD Column and centrifuge at
+
                                                                16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.</li>
+
                                                            <ul>
+
                                                                <li>Do not transfer any white pellet into the column.</li>
+
                                                            </ul>
+
                                                            <li>Add 400 µl of W1 Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for 1
+
                                                                minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.</li>
+
                                                            <li>Add 600 µl of Wash Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for
+
                                                                1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.</li>
+
                                                            <ul>
+
                                                                <li>Make sure that ethanol (96 ~ 100 %) has been added into Wash Buffer when first use.</li>
+
                                                            </ul>
+
                           
+
                                                            <li>Centrifuge at 16,000 xg for an additional 3 minutes to dry the FAPD Column.</li>
+
                                                            <ul>
+
                                                                <li>Important step! The residual liquid should be removed thoroughly on this step.</li>
+
                                                            </ul>
+
                           
+
                                                            <li>Place the FAPD Column to a new 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
+
                                                            <li>Add 30 µl of Elution Buffer or ddH2O to the membrane center of the FAPD
+
                                                                Column. Stand the column for 3 minute.
+
                                                            </li>
+
                                                            <ul>
+
                                                                <li>Important step! For effective elution, make sure that the elution solution is
+
                                                                    dispensed on the membrane center and is absorbed completely.</li>
+
                                                                <li>Do not elute the DNA using less than suggested volume (50 µl). It will lower the final yield.</li>
+
                                                            </ul>
+
                                                            <li>Centrifuge at 16,000 xg for 3 minute to elute plasmid DNA and store the DNA at -20 ℃. </li>
+
                                                        </ol>
+
                                                    </div>
+
                                                    <div class="modal-footer">
+
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    </div>
+
                                                </div>
+
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="DNS_Reductive_Sugar_Measurement" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">DNS Reductive Sugar Measurement
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <h3>DNS solution preparation:</h3>
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Disolve 2.5g of 3,5-Dinitrosalicylic acid
 +
                                                            (DNS) to 150ml double distilled water.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Heat to solution to 45 degree Celsius and
 +
                                                            add 4g of NaOH. Stir the solution until it is transparent.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 75g of potassium sodium tartrate and
 +
                                                            add water to 250 ml.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Keep the solution without light exposure.
 +
                                                            The solution can be used after 7 days.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
 +
                                                    <h3>Principle:</h3>
 +
                                                    <p class="blackp">
 +
                                                        Under base solution, DNS will turn to brown color while
 +
                                                        reacting with reductive sugar in high temperature. In the
 +
                                                        specific temperature
 +
                                                        range, the color will have linear relationship with the
 +
                                                        reductive sugar concentration.
 +
                                                    </p>
 +
 +
                                                    <h3>Calibration:</h3>
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Prepare glucose or xylose water solution
 +
                                                            to the following
 +
                                                            concentration: 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6, 2 g/L.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS
 +
                                                            solution.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Heat the sample at 100 degree Celsius for
 +
                                                            10mins.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Cool down the sample with ice to room
 +
                                                            temperature.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the optical density of the sample
 +
                                                            with 540nm light wavelength.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Draw the graph of sugar concentration
 +
                                                            with respect to optical density.</li>
 +
                                                    </ol>
  
                                        <div class="card col-4">
+
                                                     <h3>Calibration results:</h3>
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#DNS_Reductive_Sugar_Measurement">
+
                                                     <img class="contentimg" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/f/fa/T--NCKU_Tainan--home_42846829_332575510640801_8298239152197992448_n.png">
                                                <div class="post">
+
                                                    <h3>Measurement:</h3>
                                                     <span class="folded-corner"></span>
+
                                                    <ol>
                                                     <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/9/99/T--NCKU_Tainan--protocol_DNS.jpg" alt="DNS">
+
                                                        <li class="licontent">Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS
 +
                                                            solution.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Heat the sample at 100 degree Celsius for
 +
                                                            10mins.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Cool down the sample with ice to room
 +
                                                            temperature.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the optical density of the sample
 +
                                                            with 540nm light wavelength.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Get the concentration of reductive sugar
 +
                                                            from the Calibration graph.</li>
 +
                                                    </ol>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
                                                 <div class="card-body">
+
                                                 <div class="modal-footer">
                                                     <h5 class="card-title">DNS Reductive Sugar Measurement</h5>
+
                                                     <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                        <div class="modal" id="DNS_Reductive_Sugar_Measurement" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
 
                                                <div class="modal-content">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    <div class="modal-header">DNS Reductive Sugar Measurement
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                            data-target="#Short_term">
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                            <div class="post">
                                                        </button>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                    </div>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/10/T--NCKU_Tainan--protocol_short_term.jpg"
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                    alt="Short term">
                                                        <h3>DNS solution preparation:</h3>
+
                                            </div>
                                                        <ol>
+
                                            <div class="card-body">
                                                            <li>Disolve 2.5g of 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) to 150ml double distilled water.</li>
+
                                                <h5 class="card-title">Short Term pH Sensing Systen Measurement</h5>
                                                            <li>Heat to solution to 45 degree Celsius and add 4g of NaOH. Stir the solution until it is transparent.</li>
+
                                                            <li>Add 75g of potassium sodium tartrate and add water to 250 ml.</li>
+
                                                            <li>Keep the solution without light exposure. The solution can be used after 7 days.</li>
+
                                                        </ol>
+
                           
+
                                                        <h3>Principle:</h3>
+
                                                        <p class="pblack">
+
                                                            Under base solution, DNS will turn to brown color while
+
                                                            reacting with reductive sugar in high temperature. In the specific temperature
+
                                                            range, the color will have linear relationship with the reductive sugar concentration.
+
                                                        </p>
+
                           
+
                                                        <h3>Calibration:</h3>
+
                                                            <ol>
+
                                                                <li>Prepare glucose or xylose water solution to the following
+
                                                                        concentration: 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6, 2 g/L.</li>
+
                                                                <li>Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS solution.</li>
+
                                                                <li>Heat the sample at 100 degree Celsius for 10mins.</li>
+
                                                                <li>Cool down the sample with ice to room temperature.</li>
+
                                                                <li>Measure the optical density of the sample with 540nm light wavelength.</li>
+
                                                                <li>Draw the graph of sugar concentration with respect to optical density.</li>
+
                                                            </ol>
+
                           
+
                                                        <h3>Calibration results:</h3>
+
                                                        <img class="contentimg" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/f/fa/T--NCKU_Tainan--home_42846829_332575510640801_8298239152197992448_n.png">
+
                                                        <h3>Measurement:</h3>
+
                                                            <ol>
+
                                                                <li>Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS solution.</li>
+
                                                                <li>Heat the sample at 100 degree Celsius for 10mins.</li>
+
                                                                <li>Cool down the sample with ice to room temperature.</li>
+
                                                                <li>Measure the optical density of the sample with 540nm light wavelength.</li>
+
                                                                <li>Get the concentration of reductive sugar from the Calibration graph.</li>
+
                                                            </ol>
+
                                                    </div>
+
                                                    <div class="modal-footer">
+
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    </div>
+
                                                </div>
+
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
 
+
                                    </div>
                                        <div class="card col-4">
+
                                    <div class="modal" id="Short_term" tabindex="-1" role="dialog">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Long_term_pH_alert_system_measurement">
+
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
                                                <div class="post">
+
                                            <div class="modal-content">
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                                <div class="modal-header">Short Term pH Sensing Systen Measurement
                                                     <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/b/b2/T--NCKU_Tainan--protocol_Long_term.jpg" alt="Long term">
+
                                                     <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
                                                 <div class="card-body">
+
                                                 <div class="modal-body">
                                                     <h5 class="card-title">Long term pH alert system measurement</h5>
+
                                                     <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Preculture the bacteria o/n in LB, and
 +
                                                            prepared 8 different
 +
                                                            (pH4, 4.25, 4.5, 4.75, 5, 5.5, 6,7) pH value of M9 buffer.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Culture the bacteria in 6 ml LB with
 +
                                                            selective antibiotic to O.D. 0.6 (about 1.5-2hr)</li></br>
 +
                                                        <li class="licontent">Divide 6 ml of bacteria into 8
 +
                                                            eppendorfs, and centrifuged them at 1300 rpm
 +
                                                            for 1 mins in 37 ℃, then discard the supernatant
 +
                                                            completely.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 700 μl per different pH value of M9
 +
                                                            buffer into 8 different eppendorfs,
 +
                                                            respectively . And resuspend the cells completely by
 +
                                                            pipetting.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 200 μl of bacteria in 96 well (This
 +
                                                            step need triple repetition.)</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the O.D.595 nm at the first and
 +
                                                            the last time point , and the
 +
                                                            fluorescence value (485-535nm ) at every 180 sec, within 30
 +
                                                            mins.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                         <div class="modal" id="Long_term_pH_alert_system_measurement" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
 
                                                <div class="modal-content">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    <div class="modal-header">Long term pH alert system measurement
+
                                         <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                            data-target="#Long_term_pH_alert_system_measurement">
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                            <div class="post">
                                                        </button>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                    </div>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/b/b2/T--NCKU_Tainan--protocol_Long_term.jpg"
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                    alt="Long term">
                                                        <ol>
+
                                            </div>
                                                            <li>Preculture the bacteria o/n in LB, and prepared 8 different
+
                                            <div class="card-body">
                                                                (pH4,4.25,4.5,4.75,5,5.5,6,7) pH value of M9 buffer.</li>
+
                                                <h5 class="card-title">Long Term pH Sensing System Measurement</h5>
                                                            <li>Add 1/100 of the bacteria in 20 ml of different pH value of M9 buffer with
+
                                            </div>
                                                                1/1000 chloramphenicol.</li>
+
                                        </div>
                                                            <li>Culture the bacteria in the incubator in 37℃for 24 hr.</li>
+
                                    </div>
                                                            <li>Measure the O.D. value (595 nm) and the fluorescence value (485-535nm ) at every 1 hr , within 24 hr.</li>
+
                                    <div class="modal" id="Long_term_pH_alert_system_measurement" tabindex="-1" role="dialog">
                                                        </ol>
+
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
                                                    </div>
+
                                            <div class="modal-content">
                                                    <div class="modal-footer">
+
                                                <div class="modal-header">Long Term pH Sensing System Measurement
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
                                                    </div>
+
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Preculture the bacteria o/n in LB, and
 +
                                                            prepared 8 different
 +
                                                            (pH4, 5, 6, 7) pH value of M9 buffer.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 1/100 of the bacteria in 20 ml of
 +
                                                            different pH value of M9 buffer with
 +
                                                            selective antibiotic.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Culture the bacteria in the incubator in
 +
                                                            37℃for 24 hr.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Measure the O.D. value (595 nm) and the
 +
                                                            fluorescence value (485-535nm ) at every 1 hr , within 24
 +
                                                            hr.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
Line 500: Line 460:
 
                                     </div>
 
                                     </div>
 
                                 </div>
 
                                 </div>
 +
                            </div>
  
                                <div class="row">
+
                            <div class="row">
                                    <div class="card-deck">
+
                                <div class="card-deck">
                                        <div class="card col-4">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Short_term">
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                <div class="post">
+
                                            data-target="#Total_Solution">
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                            <div class="post">
                                                    <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/10/T--NCKU_Tainan--protocol_short_term.jpg" alt="Short term">
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/8/84/T--NCKU_Tainan--protocol_total_solution.png"
 +
                                                    alt="Total solution">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">Total Solution</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="Total_Solution" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">Total Solution
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
                                                 <div class="card-body">
+
                                                 <div class="modal-body">
                                                     <h5 class="card-title">Short term pH alert systen measurement</h5>
+
                                                     <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Preculture the bacteria overnight by
 +
                                                            picking up a colony in 4ml LB with antibiotic.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Culture the bacteria in 30 ml LB by
 +
                                                            adding 1/100 of precultured broth, and selective antibiotic
 +
                                                            to log phase(about 3 hr).</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge them in 22℃ ,3200xg for 5
 +
                                                            minutes , then refresh by the M9 medium with 4%xylose and
 +
                                                            0.1%LB.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Culture the bacteria for 24 hr in both O<sub>2</sub>
 +
                                                            and 5%CO<sub>2</sub> incubator, and test the O.D. value at
 +
                                                            every 6 hours.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                         <div class="modal" id="Short_term" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
 
                                                <div class="modal-content">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    <div class="modal-header">Short term pH alert systen measurement
+
                                         <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                            data-target="#Carbonic_Anhydrase_Activity_Assay">
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                            <div class="post">
                                                        </button>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                    </div>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/7b/T--NCKU_Tainan--protocol_Carbonic_anhydrase_activity_assay.jpg"
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                    alt="assay">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">Carbonic Anhydrase Activity Assay</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="Carbonic_Anhydrase_Activity_Assay" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">Carbonic Anhydrase Activity Assay
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <h3>Materials:</h3>
 +
                                                    <p class="blackp">
 +
                                                        pH meter, enzyme samples, magnetic stirrer, saturated CO2
 +
                                                        solution, 20 mM Tris-HCl
 +
                                                        buffer (pH8.3), 20mL borosilicate glass vial
 +
                                                    </p>
 +
                                                    <h3>Method:</h3>
 +
                                                    <ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Saturated CO2 solution preparation</li>
 +
                                                        <p class="blackp">Dissolve gaseous CO2 into deionized water (on
 +
                                                            ice) until it is saturated. (At least 30 min)</p>
 +
                                                        <li class="licontent">20 mM Tris HCl buffer (pH8.3) preparation</li>
 
                                                         <ol>
 
                                                         <ol>
                                                             <li>Preculture the bacteria o/n in LB, and prepared 8 different
+
                                                             <li class="licontent">Dissolve 121.14 g Tris in 800 ml
                                                                 (pH4,4.25,4.5,4.75,5,5.5,6,7) pH value of M9 buffer.</li>
+
                                                                 deionized water.</li>
                                                             <li>Culture the bacteria in 6 ml LB with 1/1000 chloramphenicol to log phase (about 1.5-2hr)</li></br>
+
                                                             <li class="licontent">Add a pH meter into the solution to
                                                             <li>Divide 6 ml of bacteria into 8 eppendorfs, and centrifuged them at 1300 rpm
+
                                                                observe the pH.</li>
                                                                 for 1 mins in 37 ℃, then discard the supernatant completely.</li>
+
                                                             <li class="licontent">Slowly add concentrated hydrochloric
                                                            <li>Add 700 μl per different pH value of M9 buffer into 8 different eppendorfs,
+
                                                                 acid (HCl) solution to reduce the pH to
                                                                 respectively . And resuspend the cells completely by pipetting.</li>
+
                                                                8.3. Be careful not to add too much at a time, since
                                                             <li>Add 200 μl of bacteria in 96 well (This step need triple repetition.)</li>
+
                                                                 the pH will change rapidly.</li>
                                                            <li>Measure the O.D.595 nm at the first and the last time point , and the
+
                                                             <li class="licontent">Once the desired pH has been reached,
                                                                 fluorescence value (485-535nm ) at every 180 sec, within 30 mins.</li>
+
                                                                 top up the solution to 1 L using deionized water.</li>
 
                                                         </ol>
 
                                                         </ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Performing Blank Reaction</li>
 +
                                                        <ol start="5">
 +
                                                            <li class="licontent">Add 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM,
 +
                                                                pH8.3) buffer into a 20 mL borosilicate
 +
                                                                glass vial with further incubation at 0 °C with
 +
                                                                stirring.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated
 +
                                                                solution immediately into the vial.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Record the time course, T<sub>0</sub>
 +
                                                                (in sec) of pH decrease from 8.3 to
 +
                                                                6.3. The pH meter must be preset to 0°C and calibrated.</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Performing Test-Sample Reaction</li>
 +
                                                        <ol start="8">
 +
                                                            <li class="licontent">Mix 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM,
 +
                                                                pH8.3) buffer and 0.2 mL enzyme, transfer
 +
                                                                the mixture to a 20 mL borosilicate glass vial with
 +
                                                                further incubation at 0 °C with stirring.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated
 +
                                                                solution immediately into the vial.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Record the time course, T (in sec) of
 +
                                                                pH decrease from 8.3 to 6.3. The pH
 +
                                                                meter must be preset to 0°C and calibrated.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Calculate CA activity using a
 +
                                                                Wilbur–Anderson unit (WAU) per milliliter of sample.</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                    </ul>
 +
                                                    <h3>Calculation:</h3>
 +
                                                    <div>
 +
                                                        <p class="blackp">
 +
                                                            Units/ml of enzyme = (T<sub>0 Average</sub> - T<sub>Average</sub>
 +
                                                            ) (df) / (T<sub>Average</sub> )(E)
 +
                                                        </p>
 
                                                     </div>
 
                                                     </div>
                                                     <div class="modal-footer">
+
                                                     <p class="blackp">T = Time (in seconds) required for pH to change
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                        from 8.3 to 6.3 as per Unit Definition</p>
                                                    </div>
+
                                                    <p class="blackp">df = dilution factor</p>
 +
                                                    <p class="blackp">E= volume (in milliliters) of enzyme used</p>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
 +
                                    </div>
  
                                        <div class="card col-4">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Carbonic_Anhydrase_Activity_Assay">
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                <div class="post">
+
                                            data-target="#Competent_Cell_Preparation">
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                            <div class="post">
                                                    <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/7/7b/T--NCKU_Tainan--protocol_Carbonic_anhydrase_activity_assay.jpg" alt="assay">
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                </div>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/3/38/T--NCKU_Tainan--protocol_competent.jpg"
                                                <div class="card-body">
+
                                                    alt="Total solution">
                                                    <h5 class="card-title">Carbonic Anhydrase Activity Assay</h5>
+
                                            </div>
                                                </div>
+
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">Competent Cell Preparation</h5>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                        <div class="modal" id="Carbonic_Anhydrase_Activity_Assay" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
                                    <div class="modal" id="Competent_Cell_Preparation" tabindex="-1" role="dialog">
                                                <div class="modal-content">
+
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
                                                    <div class="modal-header">Carbonic Anhydrase Activity Assay
+
                                            <div class="modal-content">
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                                <div class="modal-header">Competent Cell Preparation
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
                                                        </button>
+
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
                                                    </div>
+
                                                    </button>
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                </div>
                                                        <h3>Materials:</h3>
+
                                                <div class="modal-body">
                                                        <p>
+
                                                    <p class="blackp">For <i>E. coli</i> DH5α,BL21(DE3) and W3100(DE3)
                                                            pH meter, enzyme samples, magnetic stirrer, saturated CO2 solution, 20 mM Tris-HCl
+
                                                         competent cell</p>
                                                            buffer (pH8.3), 20mL borosilicate glass vial
+
                                                    <ol>
                                                         </p>
+
                                                         <li class="licontent">Streak out wild type <i>E. coli</i> on a
                                                        <h3>Method:</h3>
+
                                                             plate (LB plate without antibiotics) overnight
                                                         <ul>
+
                                                            and pick one colony into 3 ml of media (LB) and grow
                                                            <li>Saturated CO2 solution preparation</li>
+
                                                             overnight.</li>
                                                             <p class="pcontent">Dissolve gaseous CO2 into deionized water (on ice) until it is saturated. (At least 30 min)</p>
+
                                                        <li class="licontent">Transfer 0.4 ml of starter culture into
                                                             <li>20 mM Tris HCl buffer (pH8.3) preparation</li>
+
                                                            40 ml of fresh LB and grow culture at 37 ℃.</li>
                                                                <ol>
+
                                                        <li class="licontent">When the OD600 nm up to 0.35, put the
                                                                    <li>Dissolve 121.14 g Tris in 800 ml deionized water.</li>
+
                                                            cells on ice immediately.</li>
                                                                    <li>Add a pH meter into the solution to observe the pH.</li>
+
                                                        <li class="licontent">Spin the cells at 4℃ for 10 minutes at
                                                                    <li>Slowly add concentrated hydrochloric acid (HCl) solution to reduce the pH to
+
                                                            4000 rpm.</li>
                                                                        8.3. Be careful not to add too much at a time, since the pH will change rapidly.</li>
+
                                                        <li class="licontent">Suspend the pellet on ice carefully with
                                                                    <li>Once the desired pH has been reached, top up the solution to 1 L using deionized water.</li>
+
                                                            16 ml chilly Transformation Buffer 1(TFB1).</li>
                                                                </ol>
+
                                                        <li class="licontent">Leave nicely suspended bugs on ice for 10
                                                            <li>Performing Blank Reaction</li>
+
                                                            minutes.</li>
                                                            <ol start="5">
+
                                                        <li class="licontent">Spin the cells at 4℃ for 10 min. at 4000
                                                                <li>Add 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM, pH8.3) buffer into a 20 mL borosilicate
+
                                                            rpm.</li>
                                                                    glass vial with further incubation at 0 °C with stirring.</li>
+
                                                        <li class="licontent">Suspend the pellet on ice with 1.6 ml of
                                                                <li>Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated solution immediately into the vial.</li>
+
                                                            Transformation Buffer 2 (TFB2).</li>
                                                                <li>Record the time course, T<sub>0</sub> (in sec) of pH decrease from 8.3 to
+
                                                        <li class="licontent">Leave on immediately on ice for 30
                                                                    6.3. The pH meter must be preset to 0°C and calibrated.</li>
+
                                                            minutes.</li>
                                                            </ol>
+
                                                        <li class="licontent">Aliquot 100 μl into 1.5 ml centrifuge
                                                            <li>Performing Test-Sample Reaction</li>
+
                                                            tubes and snap freeze immediately with liquid nitrogen.</li>
                                                            <ol start="8">
+
                                                        <li class="licontent">Store the frozen cells in the -80℃
                                                                <li>Mix 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM, pH8.3) buffer and 0.2 mL enzyme, transfer
+
                                                             freezer.</li>
                                                                    the mixture to a 20 mL borosilicate glass vial with further incubation at 0 °C with stirring.</li>
+
                                                    </ol>
                                                                <li>Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated solution immediately into the vial.</li>
+
                                                </div>
                                                                <li>Record the time course, T (in sec) of pH decrease from 8.3 to 6.3. The pH
+
                                                <div class="modal-footer">
                                                                    meter must be preset to 0°C and calibrated.</li>
+
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
                                                                <li>Calculate CA activity using a Wilbur–Anderson unit (WAU) per milliliter of sample.</li>
+
                                                            </ol>
+
                                                        </ul>
+
                                                        <h3>Calculation:</h3>
+
                                                        <div>
+
                                                            <p>
+
                                                                Units/ml of enzyme = (T<sub>0 Average</sub> - T<sub>Average</sub> ) (df) / (T<sub>Average</sub> )(E)
+
                                                             </p>
+
                                                        </div>
+
                                                        <p>T = Time (in seconds) required for pH to change from 8.3 to 6.3 as per Unit Definition</p>
+
                                                        <p>df = dilution factor</p>
+
                                                        <p>E= volume (in milliliters) of enzyme used</p>
+
                                                    </div>
+
                                                    <div class="modal-footer">
+
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    </div>
+
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
 +
                                    </div>
 +
                                </div>
 +
                            </div>
  
                                        <div class="card col-4">
+
                            <div class="row">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Competent_Cell_Preparation">
+
                                <div class="card-deck">
                                                <div class="post">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                    <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/3/38/T--NCKU_Tainan--protocol_competent.jpg" alt="Total solution">
+
                                            data-target="#PCR">
 +
                                            <div class="post">
 +
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/0/01/T--NCKU_Tainan--protocol_PCR.jpg"
 +
                                                    alt="PCR">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">PCR</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="PCR" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">PCR
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Gently mix the following reaction by
 +
                                                            pipetting and centrifuge briefly.</li>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th></th>
 +
                                                                <th>20 μl system</th>
 +
                                                                <th>50 μl system</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Template</td>
 +
                                                                <td>12~20 ng</td>
 +
                                                                <td>30~50 ng</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Forward primer</td>
 +
                                                                <td>1.0 μl</td>
 +
                                                                <td>2.5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Reverse primer</td>
 +
                                                                <td>1.0 μl</td>
 +
                                                                <td>2.5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>dNTP</td>
 +
                                                                <td>1.6 μl</td>
 +
                                                                <td>4.0 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>10x Buffer</td>
 +
                                                                <td>2.0 μl</td>
 +
                                                                <td>5.0 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <p class="blackp">Program of KOD DNA polymerase</p>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th>Temperature</th>
 +
                                                                <th>Time</th>
 +
                                                                <th>Repeat</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>94 ℃</td>
 +
                                                                <td>3 min.</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>94 ℃</br>(Denaturation)</td>
 +
                                                                <td>40 sec</td>
 +
                                                                <td rowspan="3">25~30 cycles</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>57.5 ℃</br>(Annealing)</td>
 +
                                                                <td>30 sec</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>72 ℃</br>(Extension)</td>
 +
                                                                <td>Depend on sequence size</br>(2 kbp/min. for Taq)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>72 ℃</td>
 +
                                                                <td>5 min.</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>4 ℃</td>
 +
                                                                <td>∞</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <li class="licontent">Confirm the size of the digested product
 +
                                                            by gel electrophoresis.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Gel purification of the target size.</li>
 +
                                                    </ol>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
                                                 <div class="card-body">
+
                                                 <div class="modal-footer">
                                                     <h5 class="card-title">Competent Cell Preparation</h5>
+
                                                     <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                         <div class="modal" id="Competent_Cell_Preparation" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
 
                                                <div class="modal-content">
+
                                    <div class="card col-md-4">
                                                    <div class="modal-header">Competent Cell Preparation
+
                                         <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                            data-target="#Plasmid_Construction">
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                            <div class="post">
                                                        </button>
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                    </div>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/4/41/T--NCKU_Tainan--protocol_plasmid.jpg"
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                    alt="Plasmid Construction">
                                                        <p>For <i>E. coli</i> DH5α,BL21(DE3) and W3100(DE3) competent cell</p>
+
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">Plasmid Construction</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="Plasmid_Construction" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">Plasmid Construction
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <div id="Plasmid_Construction">
 
                                                         <ol>
 
                                                         <ol>
                                                             <li>Streak out wild type <i>E. coli</i> on a plate (LB plate without antibiotics) overnight
+
                                                             <li class="licontent">Digestion (vector)</li>
                                                                 and pick one colony into 3 ml of media (LB) and grow overnight.</li>
+
                                                        </ol>
                                                             <li>Transfer 0.4 ml of starter culture into 40 ml of fresh LB and grow culture at 37 ℃.</li>
+
                                                        <table class="centertable">
                                                             <li>When the OD600 nm up to 0.35, put the cells on ice immediately.</li>
+
                                                            <tr>
                                                             <li>Spin the cells at 4℃ for 10 minutes at 4000 rpm.</li>
+
                                                                 <th>Plasmid</th>
                                                             <li>Suspend the pellet on ice carefully with 16 ml chilly Transformation Buffer 1(TFB1).</li>
+
                                                                 <th>200 ng</th>
                                                             <li>Leave nicely suspended bugs on ice for 10 minutes.</li>
+
                                                                <th>1000 ng</th>
                                                             <li>Spin the cells at 4℃ for 10 min. at 4000 rpm.</li>
+
                                                             </tr>
                                                             <li>Suspend the pellet on ice with 1.6 ml of Transformation Buffer 2 (TFB2).</li>
+
                                                            <tr>
                                                             <li>Leave on immediately on ice for 30 minutes.</li>
+
                                                                <td>EcoRI-HF</td>
                                                             <li>Aliquot 100 μl into 1.5 ml centrifuge tubes and snap freeze immediately with liquid nitrogen.</li>
+
                                                                <td>0.2 μl</td>
                                                             <li>Store the frozen cells in the -80℃ freezer.</li>
+
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                             </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>SpeI-HF</td>
 +
                                                                <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                                                <td>2 μl</td>
 +
                                                                <td>5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>17.6 μl</td>
 +
                                                                <td>43 μl</td>
 +
                                                             </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td><b>Total</b></td>
 +
                                                                <td><b>20 μl</b></td>
 +
                                                                <td><b>50 μl</b></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <ol start="2">
 +
                                                             <li class="licontent">Digestion (insert)</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                             <tr>
 +
                                                                <th>Plasmid</th>
 +
                                                                <th>200 ng</th>
 +
                                                                <th>1000 ng</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>EcoRI-HF</td>
 +
                                                                <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                             </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>XbaI</td>
 +
                                                                <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                                                <td>2 μl</td>
 +
                                                                <td>5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>17.6 μl</td>
 +
                                                                <td>43 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td><b>Total</b></td>
 +
                                                                <td><b>20 μl</b></td>
 +
                                                                <td><b>50 μl</b></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <ol start="3">
 +
                                                             <li class="licontent">Confirm the size of the digested
 +
                                                                product by gel electrophoresis.</li>
 +
                                                             <li class="licontent">Gel purification of the target size.</li>
 +
                                                             <li class="licontent">Ligation</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th>Ingredient</th>
 +
                                                                <th>Volume</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Vector (2 kbp)</td>
 +
                                                                <td rowspan="2">molar ratio = 1:3</br>(can be up to
 +
                                                                    1:10, depends on the sizes of DNA)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Insert (1.5 kbp)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Quick Ligase Reaction Buffer (2X)*</td>
 +
                                                                <td>10 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Quick Ligase</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>Up to 20 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <ol start="6">
 +
                                                             <li class="licontent">Transform the product by heat shock.</li>
 
                                                         </ol>
 
                                                         </ol>
                                                    </div>
 
                                                    <div class="modal-footer">
 
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
 
                                                     </div>
 
                                                     </div>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
 
                                     </div>
 
                                     </div>
                                </div>
 
  
                                <div class="row">
+
                                     <div class="card col-md-4">
                                     <div class="card-deck">
+
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
                                        <div class="card col-4">
+
                                            data-target="#PCR_Clean_Up">
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Total_Solution">
+
                                            <div class="post">
                                                <div class="post">
+
                                                <span class="folded-corner"></span>
                                                    <span class="folded-corner"></span>
+
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/3/34/T--NCKU_Tainan--protocol_PCR_cleanup.jpg"
                                                    <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/8/84/T--NCKU_Tainan--protocol_total_solution.png" alt="Total solution">
+
                                                    alt="Clean Up">
                                                </div>
+
                                            </div>
                                                <div class="card-body">
+
                                            <div class="card-body">
                                                    <h5 class="card-title">Total Solution</h5>
+
                                                <h5 class="card-title">PCR Clean-Up & Gel Extraction</h5>
                                                </div>
+
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                        <div class="modal" id="Total_Solution" tabindex="-1" role="dialog">
+
                                    </div>
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
+
                                    <div class="modal" id="PCR_Clean_Up" tabindex="-1" role="dialog">
                                                <div class="modal-content">
+
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
                                                    <div class="modal-header">Total Solution
+
                                            <div class="modal-content">
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
+
                                                <div class="modal-header">PCR Clean-Up & Gel Extraction
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
+
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
                                                        </button>
+
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
                                                    </div>
+
                                                    </button>
                                                    <div class="modal-body">
+
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <h3>Gel Dissociation</h3>
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Gel Extraction</li>
 
                                                         <ol>
 
                                                         <ol>
                                                             <li>Preculture the bacteria overnight by picking up a colony in 4ml LB with  antibiotic.</li>
+
                                                             <li class="licontent">Excised the DNA fragment from the
                                                             <li>Culture the bacteria in 30 ml LB by adding 1/100 of precultured broth, 1/2000
+
                                                                agarose gel.</li>
                                                                 kanamycin, 1/4000 chloramphenicol to log phase(about 3 hr).</li>
+
                                                             <li class="licontent">Transferred up to 300 mg of the gel
                                                             <li>Centrifuge them in 22℃ ,3200xg for 5 minutes , then refresh by the M9 medium with 4%xylose and 0.1%LB.</li>
+
                                                                slice to a 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
                                                             <li>Culture the bacteria for 24 hr in both O<sub>2</sub> and 5%CO<sub>2</sub> incubator, and test the O.D. value at every 6 hours.</li>
+
                                                            <li class="licontent">Added 500 μl of the Gel/PCR Bufffer
 +
                                                                 to the sample and mixed by vortex.</li>
 +
                                                             <li class="licontent">Incubate at 55~60℃ for 10 minutes (or
 +
                                                                until the gel slice has completely dissolved).</li>
 +
                                                             <li class="licontent">During the incubation, mixed by
 +
                                                                vortexing the tube every 2~3 minutes.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Cooled the dissolved sample mixture
 +
                                                                to the room temperature.</li>
 
                                                         </ol>
 
                                                         </ol>
                                                     </div>
+
                                                     </ol>
                                                     <div class="modal-footer">
+
                                                     <h3>DNA Binding</h3>
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
+
                                                    <ol start="2">
                                                    </div>
+
                                                        <li class="licontent">Placed a PG Column in a Collection Tube.
 +
                                                            Apply the supernatant to the PG Column by decanting or
 +
                                                            pipetting.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Discarded the flow-through and place the
 +
                                                            PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                    <h3>Wash</h3>
 +
                                                    <ol start="5">
 +
                                                        <li class="licontent">Added 400 μl of the Buffer W1 into the PG
 +
                                                            Column.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Discarded the flow-through and place the
 +
                                                            PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Added 600 μl of the Buffer W2 (ethanol
 +
                                                            added) into the PG Column.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Discarded the flow-through and place the
 +
                                                            PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg again for 2
 +
                                                            minutes to remove the residual Buffer W2.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                    <h3>Elution</h3>
 +
                                                    <ol start="12">
 +
                                                        <li class="licontent">To elute the DNA, placed the PG Column in
 +
                                                            a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Added 50 μl of the H<sub>2</sub>O (pH is
 +
                                                            between 7.0 and 8.5) to the center of each PG
 +
                                                            Column, let it stand for at least 2 minutes, and centrifuge
 +
                                                            at 16,000 xg for 2 min.
 +
                                                        </li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 
                                                 </div>
 
                                                 </div>
 
                                             </div>
 
                                             </div>
 
                                         </div>
 
                                         </div>
                                        <div class="card col-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
 
                                        <div class="card col-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
 
 
                                     </div>
 
                                     </div>
 +
                                </div>
 +
                            </div>
 +
 +
                            <div class="row">
 +
                                <div class="card-deck">
 +
                                    <div class="card col-md-4">
 +
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
 +
                                            data-target="#Plasmid_Extraction">
 +
                                            <div class="post">
 +
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/1a/T--NCKU_Tainan--protocol_extraction.jpg"
 +
                                                    alt="Extraction">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">Plasmid Extraction</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="Plasmid_Extraction" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">Plasmid Extraction
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Transfer 1.4 ml of well-grown bacterial
 +
                                                            culture to a centrifuge tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge the tube at 16,000 xg for 1
 +
                                                            minute to pellet the cells and
 +
                                                            discard the supernatant completely.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 200 µl of FAPD1 Buffer (RNaseA added)
 +
                                                            to the cell pellet and resuspend
 +
                                                            the cells completely by pipetting.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Make sure that RNaseA has been added
 +
                                                                into FAPD1 Buffer when first use.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">No cell pellet should be visible
 +
                                                                after resuspension of the cells.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 200 µl of FAPD2 Buffer and gently
 +
                                                            invert the tube 5 ~ 10 times.
 +
                                                            Incubate the sample mixture at room temperature for 2 ~ 5
 +
                                                            minutes to lyse the cells.
 +
                                                        </li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not vortex, vortex may shear
 +
                                                                genomic DNA. If necessary, continue
 +
                                                                inverting the tube until the lysate become clear.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Make sure the tube transfer to
 +
                                                                clarify from turbid.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not proceed with the incubation
 +
                                                                over 5 minutes.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 300 µl of FAPD3 Buffer and invert the
 +
                                                            tube 5 ~ 10 times immediately to neutralize the lysate.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Invert immediately after adding FAPD3
 +
                                                                Buffer will avoid asymmetric precipitation.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge at 16,000 xg for 3 minutess.
 +
                                                            to clarify the lysate. During
 +
                                                            centrifugation, place a FAPD Column in a Collection Tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Transfer the supernatant carefully to the
 +
                                                            FAPD Column and centrifuge at
 +
                                                            16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place
 +
                                                            the column back to the Collection Tube.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not transfer any white pellet into
 +
                                                                the column.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 400 µl of W1 Buffer to the FAPD
 +
                                                            Column and centrifuge at 16,000 xg for 1
 +
                                                            minute. Discard the flow-through and place the column back
 +
                                                            to the Collection Tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 600 µl of Wash Buffer to the FAPD
 +
                                                            Column and centrifuge at 16,000 xg for
 +
                                                            1 minute. Discard the flow-through and place the column
 +
                                                            back to the Collection Tube.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Make sure that ethanol (96 ~ 100 %)
 +
                                                                has been added into Wash Buffer when first use.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge at 16,000 xg for an additional
 +
                                                            3 minutes to dry the FAPD Column.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Important step! The residual liquid
 +
                                                                should be removed thoroughly on this step.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
 +
                                                        <li class="licontent">Place the FAPD Column to a new 1.5 ml
 +
                                                            microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 30 µl of Elution Buffer or ddH<sub>2</sub>O
 +
                                                            to the membrane center of the FAPD
 +
                                                            Column. Stand the column for 3 minute.
 +
                                                        </li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Important step! For effective
 +
                                                                elution, make sure that the elution solution is
 +
                                                                dispensed on the membrane center and is absorbed
 +
                                                                completely.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not elute the DNA using less than
 +
                                                                suggested volume (50 µl). It will lower the final
 +
                                                                yield.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge at 16,000 xg for 3 minute to
 +
                                                            elute plasmid DNA and store the DNA at -20 ℃. </li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="card col-md-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
 +
                                    <div class="card col-md-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
 
                                 </div>
 
                                 </div>
 
                             </div>
 
                             </div>
Line 706: Line 1,121:
 
             </div>
 
             </div>
 
         </div>
 
         </div>
 +
    </div>
 
     <script>
 
     <script>
         $(document).ready(function() {
+
         $(document).ready(function () {
          $(window).scroll(function() {
+
            $(window).scroll(function () {
            var scrollPercentage = (document.documentElement.scrollTop + document.body.scrollTop) / (document.documentElement.scrollHeight - document.documentElement.clientHeight);    
+
                var scrollPercentage = (document.documentElement.scrollTop + document.body.scrollTop) /
            if(scrollPercentage >= 0.97) {
+
                    (document.documentElement.scrollHeight - document.documentElement.clientHeight);
              var position = $("#sidelist").position();
+
                if (scrollPercentage >= 0.95) {
              if(position == undefined){}
+
                    var position = $("#sidelist").position();
              else{
+
                    if (position == undefined) {} else {
                $('#sidelist').css({"position": "fixed", "top": "95px"});
+
                        $('#sidelist').css({
              }
+
                            "position": "fixed",
            } else {
+
                            "top": "105px"
              if ($(this).scrollTop() >= 90) {
+
                        });
                var position = $("#sidelist").position();
+
                    }
                if(position == undefined){}
+
                } else {
                else{
+
                    if ($(this).scrollTop() >= 50) {
                  $('#sidelist').css({"position": "fixed", "top": "145px", "margin-top": "0px"});
+
                        var position = $("#sidelist").position();
 +
                        if (position == undefined) {} else {
 +
                            $('#sidelist').css({
 +
                                "position": "fixed",
 +
                                "top": "145px",
 +
                                "margin-top": "0px"
 +
                            });
 +
                        }
 +
                    } else {
 +
                        $('#sidelist').removeAttr('style');
 +
                    }
 
                 }
 
                 }
              } else {
 
                $('#sidelist').removeAttr('style');
 
              }
 
            } 
 
          });
 
          $(function(){
 
            $('i.fa-arrow-up').click(function(){
 
            $('html, body').animate({scrollTop:0},600);
 
              return false;
 
 
             });
 
             });
          });
+
            $(function () {
 +
                $('i.fa-arrow-up').click(function () {
 +
                    $('html, body').animate({
 +
                        scrollTop: 0
 +
                    }, 600);
 +
                    return false;
 +
                });
 +
            });
 
         });
 
         });
 
     </script>
 
     </script>
 
     <script src="https://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan/js/frame/T--NCKU_Tainan--jquery-1_12_4_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 
     <script src="https://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan/js/frame/T--NCKU_Tainan--jquery-1_12_4_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 
     <script src="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/js/bootstrap_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 
     <script src="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/js/bootstrap_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
    </body>
+
</body>
   
+
 
 
</html>
 
</html>
 
{{NCKU_Tainan/footer}}
 
{{NCKU_Tainan/footer}}

Latest revision as of 00:20, 3 November 2018

Protocol

Read
Follow us

Contact us

igem.ncku.tainan@gmail.com
No.1, Daxue Rd., East Dist., Tainan City 701, Taiwan (R.O.C.)