Difference between revisions of "Team:NCKU Tainan/Protocol"

 
(2 intermediate revisions by the same user not shown)
Line 659: Line 659:
 
                             </div>
 
                             </div>
  
 +
                            <div class="row">
 +
                                <div class="card-deck">
 +
                                    <div class="card col-md-4">
 +
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
 +
                                            data-target="#PCR">
 +
                                            <div class="post">
 +
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/0/01/T--NCKU_Tainan--protocol_PCR.jpg"
 +
                                                    alt="PCR">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">PCR</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="PCR" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">PCR
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Gently mix the following reaction by
 +
                                                            pipetting and centrifuge briefly.</li>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th></th>
 +
                                                                <th>20 μl system</th>
 +
                                                                <th>50 μl system</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Template</td>
 +
                                                                <td>12~20 ng</td>
 +
                                                                <td>30~50 ng</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Forward primer</td>
 +
                                                                <td>1.0 μl</td>
 +
                                                                <td>2.5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Reverse primer</td>
 +
                                                                <td>1.0 μl</td>
 +
                                                                <td>2.5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>dNTP</td>
 +
                                                                <td>1.6 μl</td>
 +
                                                                <td>4.0 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>10x Buffer</td>
 +
                                                                <td>2.0 μl</td>
 +
                                                                <td>5.0 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <p class="blackp">Program of KOD DNA polymerase</p>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th>Temperature</th>
 +
                                                                <th>Time</th>
 +
                                                                <th>Repeat</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>94 ℃</td>
 +
                                                                <td>3 min.</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>94 ℃</br>(Denaturation)</td>
 +
                                                                <td>40 sec</td>
 +
                                                                <td rowspan="3">25~30 cycles</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>57.5 ℃</br>(Annealing)</td>
 +
                                                                <td>30 sec</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>72 ℃</br>(Extension)</td>
 +
                                                                <td>Depend on sequence size</br>(2 kbp/min. for Taq)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>72 ℃</td>
 +
                                                                <td>5 min.</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>4 ℃</td>
 +
                                                                <td>∞</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <li class="licontent">Confirm the size of the digested product
 +
                                                            by gel electrophoresis.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Gel purification of the target size.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
  
 +
                                    <div class="card col-md-4">
 +
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
 +
                                            data-target="#Plasmid_Construction">
 +
                                            <div class="post">
 +
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/4/41/T--NCKU_Tainan--protocol_plasmid.jpg"
 +
                                                    alt="Plasmid Construction">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">Plasmid Construction</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="Plasmid_Construction" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">Plasmid Construction
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <div id="Plasmid_Construction">
 +
                                                        <ol>
 +
                                                            <li class="licontent">Digestion (vector)</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th>Plasmid</th>
 +
                                                                 <th>200 ng</th>
 +
                                                                <th>1000 ng</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>EcoRI-HF</td>
 +
                                                                <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>SpeI-HF</td>
 +
                                                                <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                                                <td>2 μl</td>
 +
                                                                <td>5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>17.6 μl</td>
 +
                                                                <td>43 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td><b>Total</b></td>
 +
                                                                <td><b>20 μl</b></td>
 +
                                                                <td><b>50 μl</b></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <ol start="2">
 +
                                                            <li class="licontent">Digestion (insert)</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th>Plasmid</th>
 +
                                                                <th>200 ng</th>
 +
                                                                <th>1000 ng</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>EcoRI-HF</td>
 +
                                                                <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>XbaI</td>
 +
                                                                <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                                                <td>2 μl</td>
 +
                                                                <td>5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>17.6 μl</td>
 +
                                                                <td>43 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td><b>Total</b></td>
 +
                                                                <td><b>20 μl</b></td>
 +
                                                                <td><b>50 μl</b></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <ol start="3">
 +
                                                            <li class="licontent">Confirm the size of the digested
 +
                                                                product by gel electrophoresis.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Gel purification of the target size.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Ligation</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th>Ingredient</th>
 +
                                                                <th>Volume</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Vector (2 kbp)</td>
 +
                                                                <td rowspan="2">molar ratio = 1:3</br>(can be up to
 +
                                                                    1:10, depends on the sizes of DNA)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Insert (1.5 kbp)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Quick Ligase Reaction Buffer (2X)*</td>
 +
                                                                <td>10 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Quick Ligase</td>
 +
                                                                <td>1 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>Up to 20 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <ol start="6">
 +
                                                            <li class="licontent">Transform the product by heat shock.</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
  
 +
                                    <div class="card col-md-4">
 +
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
 +
                                            data-target="#PCR_Clean_Up">
 +
                                            <div class="post">
 +
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/3/34/T--NCKU_Tainan--protocol_PCR_cleanup.jpg"
 +
                                                    alt="Clean Up">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">PCR Clean-Up & Gel Extraction</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="PCR_Clean_Up" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">PCR Clean-Up & Gel Extraction
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <h3>Gel Dissociation</h3>
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Gel Extraction</li>
 +
                                                        <ol>
 +
                                                            <li class="licontent">Excised the DNA fragment from the
 +
                                                                agarose gel.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Transferred up to 300 mg of the gel
 +
                                                                slice to a 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Added 500 μl of the Gel/PCR Bufffer
 +
                                                                to the sample and mixed by vortex.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Incubate at 55~60℃ for 10 minutes (or
 +
                                                                until the gel slice has completely dissolved).</li>
 +
                                                            <li class="licontent">During the incubation, mixed by
 +
                                                                vortexing the tube every 2~3 minutes.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Cooled the dissolved sample mixture
 +
                                                                to the room temperature.</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                    <h3>DNA Binding</h3>
 +
                                                    <ol start="2">
 +
                                                        <li class="licontent">Placed a PG Column in a Collection Tube.
 +
                                                            Apply the supernatant to the PG Column by decanting or
 +
                                                            pipetting.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Discarded the flow-through and place the
 +
                                                            PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                    <h3>Wash</h3>
 +
                                                    <ol start="5">
 +
                                                        <li class="licontent">Added 400 μl of the Buffer W1 into the PG
 +
                                                            Column.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Discarded the flow-through and place the
 +
                                                            PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Added 600 μl of the Buffer W2 (ethanol
 +
                                                            added) into the PG Column.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Discarded the flow-through and place the
 +
                                                            PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuged at 16,000 xg again for 2
 +
                                                            minutes to remove the residual Buffer W2.</li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                    <h3>Elution</h3>
 +
                                                    <ol start="12">
 +
                                                        <li class="licontent">To elute the DNA, placed the PG Column in
 +
                                                            a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Added 50 μl of the H<sub>2</sub>O (pH is
 +
                                                            between 7.0 and 8.5) to the center of each PG
 +
                                                            Column, let it stand for at least 2 minutes, and centrifuge
 +
                                                            at 16,000 xg for 2 min.
 +
                                                        </li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                </div>
 +
                            </div>
 +
 +
                            <div class="row">
 +
                                <div class="card-deck">
 +
                                    <div class="card col-md-4">
 +
                                        <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal"
 +
                                            data-target="#Plasmid_Extraction">
 +
                                            <div class="post">
 +
                                                <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                <img class="card-img-top" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/1/1a/T--NCKU_Tainan--protocol_extraction.jpg"
 +
                                                    alt="Extraction">
 +
                                            </div>
 +
                                            <div class="card-body">
 +
                                                <h5 class="card-title">Plasmid Extraction</h5>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="modal" id="Plasmid_Extraction" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                        <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                            <div class="modal-content">
 +
                                                <div class="modal-header">Plasmid Extraction
 +
                                                    <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                        <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                    </button>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-body">
 +
                                                    <ol>
 +
                                                        <li class="licontent">Transfer 1.4 ml of well-grown bacterial
 +
                                                            culture to a centrifuge tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge the tube at 16,000 xg for 1
 +
                                                            minute to pellet the cells and
 +
                                                            discard the supernatant completely.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 200 µl of FAPD1 Buffer (RNaseA added)
 +
                                                            to the cell pellet and resuspend
 +
                                                            the cells completely by pipetting.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Make sure that RNaseA has been added
 +
                                                                into FAPD1 Buffer when first use.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">No cell pellet should be visible
 +
                                                                after resuspension of the cells.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 200 µl of FAPD2 Buffer and gently
 +
                                                            invert the tube 5 ~ 10 times.
 +
                                                            Incubate the sample mixture at room temperature for 2 ~ 5
 +
                                                            minutes to lyse the cells.
 +
                                                        </li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not vortex, vortex may shear
 +
                                                                genomic DNA. If necessary, continue
 +
                                                                inverting the tube until the lysate become clear.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Make sure the tube transfer to
 +
                                                                clarify from turbid.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not proceed with the incubation
 +
                                                                over 5 minutes.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 300 µl of FAPD3 Buffer and invert the
 +
                                                            tube 5 ~ 10 times immediately to neutralize the lysate.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Invert immediately after adding FAPD3
 +
                                                                Buffer will avoid asymmetric precipitation.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge at 16,000 xg for 3 minutess.
 +
                                                            to clarify the lysate. During
 +
                                                            centrifugation, place a FAPD Column in a Collection Tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Transfer the supernatant carefully to the
 +
                                                            FAPD Column and centrifuge at
 +
                                                            16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place
 +
                                                            the column back to the Collection Tube.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not transfer any white pellet into
 +
                                                                the column.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 400 µl of W1 Buffer to the FAPD
 +
                                                            Column and centrifuge at 16,000 xg for 1
 +
                                                            minute. Discard the flow-through and place the column back
 +
                                                            to the Collection Tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 600 µl of Wash Buffer to the FAPD
 +
                                                            Column and centrifuge at 16,000 xg for
 +
                                                            1 minute. Discard the flow-through and place the column
 +
                                                            back to the Collection Tube.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Make sure that ethanol (96 ~ 100 %)
 +
                                                                has been added into Wash Buffer when first use.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge at 16,000 xg for an additional
 +
                                                            3 minutes to dry the FAPD Column.</li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Important step! The residual liquid
 +
                                                                should be removed thoroughly on this step.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
 +
                                                        <li class="licontent">Place the FAPD Column to a new 1.5 ml
 +
                                                            microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                        <li class="licontent">Add 30 µl of Elution Buffer or ddH<sub>2</sub>O
 +
                                                            to the membrane center of the FAPD
 +
                                                            Column. Stand the column for 3 minute.
 +
                                                        </li>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li class="licontent">Important step! For effective
 +
                                                                elution, make sure that the elution solution is
 +
                                                                dispensed on the membrane center and is absorbed
 +
                                                                completely.</li>
 +
                                                            <li class="licontent">Do not elute the DNA using less than
 +
                                                                suggested volume (50 µl). It will lower the final
 +
                                                                yield.</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <li class="licontent">Centrifuge at 16,000 xg for 3 minute to
 +
                                                            elute plasmid DNA and store the DNA at -20 ℃. </li>
 +
                                                    </ol>
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="modal-footer">
 +
                                                    <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                    <div class="card col-md-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
 +
                                    <div class="card col-md-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
 +
                                </div>
 +
                            </div>
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                     </div>
 
                     </div>
Line 667: Line 1,122:
 
         </div>
 
         </div>
 
     </div>
 
     </div>
 
+
    <script>
 +
        $(document).ready(function () {
 +
            $(window).scroll(function () {
 +
                var scrollPercentage = (document.documentElement.scrollTop + document.body.scrollTop) /
 +
                    (document.documentElement.scrollHeight - document.documentElement.clientHeight);
 +
                if (scrollPercentage >= 0.95) {
 +
                    var position = $("#sidelist").position();
 +
                    if (position == undefined) {} else {
 +
                        $('#sidelist').css({
 +
                            "position": "fixed",
 +
                            "top": "105px"
 +
                        });
 +
                    }
 +
                } else {
 +
                    if ($(this).scrollTop() >= 50) {
 +
                        var position = $("#sidelist").position();
 +
                        if (position == undefined) {} else {
 +
                            $('#sidelist').css({
 +
                                "position": "fixed",
 +
                                "top": "145px",
 +
                                "margin-top": "0px"
 +
                            });
 +
                        }
 +
                    } else {
 +
                        $('#sidelist').removeAttr('style');
 +
                    }
 +
                }
 +
            });
 +
            $(function () {
 +
                $('i.fa-arrow-up').click(function () {
 +
                    $('html, body').animate({
 +
                        scrollTop: 0
 +
                    }, 600);
 +
                    return false;
 +
                });
 +
            });
 +
        });
 +
    </script>
 +
    <script src="https://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan/js/frame/T--NCKU_Tainan--jquery-1_12_4_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 +
    <script src="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/js/bootstrap_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 
</body>
 
</body>
  
 
</html>
 
</html>
 
{{NCKU_Tainan/footer}}
 
{{NCKU_Tainan/footer}}

Latest revision as of 00:20, 3 November 2018

Protocol

Read
Follow us

Contact us

igem.ncku.tainan@gmail.com
No.1, Daxue Rd., East Dist., Tainan City 701, Taiwan (R.O.C.)