Difference between revisions of "Team:NCKU Tainan/Protocol"

Line 1: Line 1:
 
{{NCKU_Tainan/header}} {{NCKU_Tainan/navbar}} {{NCKU_Tainan/style}}
 
{{NCKU_Tainan/header}} {{NCKU_Tainan/navbar}} {{NCKU_Tainan/style}}
−
 
 
<html>
 
<html>
−
 
+
    <head>
−
<head>
+
        <link rel="stylesheet" href="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/css/protocol_style?action=raw&ctype=text/css">
−
    <link rel="stylesheet" href="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/css/protocol_style?action=raw&ctype=text/css">
+
    </head>
−
</head>
+
    <body data-spy="scroll" data-target=".navbar-example">
−
 
+
        <div class="container content">
−
<body data-spy="scroll" data-target=".navbar-example">
+
−
 
+
−
    <div class="container content">
+
 
         <h1 class="head">Protocol</h1>
 
         <h1 class="head">Protocol</h1>
−
        <div class="navbar-example">
+
            <div class="navbar-example">
−
            <div class="row">
+
                <div class="row">
−
                <div class="col-3 side">
+
                    <div class="col-12">
−
                    <div id="sidelist" class="list-Fgroup">
+
                        <div data-spy="scroll" data-target="#sidelist" data-offset="0" class="scrollspy-example">
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-1">PCR</a>
+
                            <div class="container">
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-2">Plasmid Construction</a>
+
                                <div class="row">
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-3">PCR Clean-Up & Gel
+
                                    <div class="card-deck">
−
                            Extraction</a>
+
                                        <div class="card col-4">
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-4">Plasmid Extraction</a>
+
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#PCR">
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-5">DNS reductive sugar
+
                                                <div class="post">
−
                            measurement</a>
+
                                                    <span class="folded-corner"></span>
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-6">pH24</a>
+
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/PCR.jpg" alt="PCR">
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-7">pH30</a>
+
                                                </div>
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-8">Carbonic Anhydrase
+
                                                <div class="card-body">
−
                            Activity Assay</a>
+
                                                    <h5 class="card-title">PCR</h5>
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#list-item-9">Total Solution</a>
+
                                                </div>
−
                        <a class="list-group-item list-group-item-action" href="#"><i class="fa fa-arrow-up fa-1x"
+
                                            </div>
−
                                aria-hidden="true"></i></a>
+
                                        </div>
−
                    </div>
+
                                        <div class="modal" id="PCR" tabindex="-1" role="dialog">
−
                </div>
+
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
−
                <div class="col-9">
+
                                                <div class="modal-content">
−
                    <div data-spy="scroll" data-target="#sidelist" data-offset="0" class="scrollspy-example">
+
                                                    <div class="modal-header">PCR
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol start="1">
 +
                                                                <li>Gently mix the following reaction by pipetting and centrifuge briefly.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th></th>
 +
                                                                <th>20 μl system</th>
 +
                                                                <th>50 μl system</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Template</td>
 +
                                                                <td>12～20 ng</td>
 +
                                                                <td>30～50 ng</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Forward primer</td>
 +
                                                                <td>1.0 μl</td>
 +
                                                                <td>2.5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Reverse primer</td>
 +
                                                                <td>1.0 μl</td>
 +
                                                                <td>2.5 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>dNTP</td>
 +
                                                                <td>1.6 μl</td>
 +
                                                                <td>4.0 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>10x Buffer</td>
 +
                                                                <td>2.0 μl</td>
 +
                                                                <td>5.0 μl</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <p class="pcontent">Program of KOD DNA polymerase</p>
 +
                                                        <table class="centertable">
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <th>Temperature</th>
 +
                                                                <th>Time</th>
 +
                                                                <th>Repeat</th>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>94 ℃</td>
 +
                                                                <td>3 min.</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>94 ℃</br>(Denaturation)</td>
 +
                                                                <td>40 sec</td>
 +
                                                                <td rowspan="3">25～30 cycles</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>57.5 ℃</br>(Annealing)</td>
 +
                                                                <td>30 sec</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>72 ℃</br>(Extension)</td>
 +
                                                                <td>Depend on sequence size</br>(2 kbp/min. for Taq)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>72 ℃</td>
 +
                                                                <td>5 min.</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>4 ℃</td>
 +
                                                                <td>∞</td>
 +
                                                                <td></td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol start="2">
 +
                                                                <li>Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.</li>
 +
                                                                <li>Gel purification of the target size.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                            </br>
 +
                                                        </p>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                       
 +
                                        <div class="card col-4">
 +
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Plasmid_Construction">
 +
                                                <div class="post">
 +
                                                    <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/Plasmid-Construction.jpg" alt="Plasmid Construction">
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="card-body">
 +
                                                    <h5 class="card-title">Plasmid Construction</h5>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                        <div class="modal" id="Plasmid_Construction" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">Plasmid Construction
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <div id="Plasmid_Construction">
 +
                                                            <p class="pcontent">
 +
                                                                <ol>
 +
                                                                    <li>Digestion (vector)</li>
 +
                                                                </ol>
 +
                                                            </p>
 +
                                                            <table class="centertable">
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <th>Plasmid</th>
 +
                                                                  　<th>200 ng</th>
 +
                                                                    <th>1000 ng</th>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>EcoRI-HF</td>
 +
                                                                    <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                    <td>1 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>SpeI-HF</td>
 +
                                                                    <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                    <td>1 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                                                    <td>2 μl</td>
 +
                                                                    <td>5 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                    <td>Up to 20 μl</td>
 +
                                                                    <td>Up to 50 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
 +
                                                                    <td></td>
 +
                                                                    <td></td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                            </table>
 +
                                                            <p class="pcontent">
 +
                                                                <ol start="2">
 +
                                                                    <li>Digestion (insert)</li>
 +
                                                                </ol>
 +
                                                            </p>
 +
                                                            <table class="centertable">
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <th>Plasmid</th>
 +
                                                                    <th>200 ng</th>
 +
                                                                    <th>1000 ng</th>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>EcoRI-HF</td>
 +
                                                                    <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                    <td>1 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>XbaI</td>
 +
                                                                    <td>0.2 μl</td>
 +
                                                                    <td>1 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>CutSmart Buffer</td>
 +
                                                                    <td>2 μl</td>
 +
                                                                    <td>5 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                    <td>Up to 20 μl</td>
 +
                                                                    <td>Up to 50 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
 +
                                                                    <td></td>
 +
                                                                    <td></td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                            </table>
 +
                                                            <p class="pcontent">
 +
                                                                <ol start="3">
 +
                                                                    <li>Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.</li>
 +
                                                                    <li>Gel purification of the target size.</li>
 +
                                                                    <li>Ligation</li>
 +
                                                                </ol>
 +
                                                            </p>
 +
                                                            <table class="centertable">
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <th>Ingredient</th>
 +
                                                                    <th>Volume</th>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>Vector (2 kbp)</td>
 +
                                                                    <td rowspan="2">molar ratio = 1:3</br>(can be up to 1:10, depends on the sizes of DNA)</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>Insert (1.5 kbp)</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>Quick Ligase Reaction Buffer (2X)*</td>
 +
                                                                    <td>10 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>Quick Ligase</td>
 +
                                                                    <td>1 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                                <tr>
 +
                                                                    <td>ddH<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                    <td>Up to 20 μl</td>
 +
                                                                </tr>
 +
                                                            </table>
 +
                                                            <p class="pcontent">
 +
                                                                <ol start="6">
 +
                                                                    <li>Transform the product by heat shock.</li>
 +
                                                                </ol>
 +
                                                            </p>
 +
                                                        </div>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
  
−
                        <div id="list-item-1">
+
                                        <div class="card col-4">
−
                            </br></br></br></br>
+
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#PCR_Clean_Up">
−
                            <div class="row">
+
                                                <div class="post">
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#PCR" role="button" aria-expanded="false"
+
                                                    <span class="folded-corner"></span>
−
                                    aria-controls="multiCollapseExample1" style="color: white; hover: #002bb8;">
+
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/PCR Clean-Up & Gel Extraction.jpg" alt="Clean Up">
−
                                    PCR
+
                                                </div>
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
                                                <div class="card-body">
−
                                </a>
+
                                                    <h5 class="card-title">PCR Clean-Up & Gel Extraction</h5>
−
                            </div>
+
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                        <div class="modal" id="PCR_Clean_Up" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">PCR Clean-Up & Gel Extraction
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol>
 +
                                                                <li>Gel Extraction</li>
 +
                                                                <ol type="a">
 +
                                                                    <li>Excised the DNA fragment from the agarose gel.</li>
 +
                                                                    <li>Transferred up to 300 mg of the gel slice to a 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                                    <li>Added 500 μl of the Gel/PCR Bufffer to the sample and mixed by vortex.</li>
 +
                                                                    <li>Incubate at 55~60℃ for 10 minutes (or until the gel slice has completely dissolved).</li>
 +
                                                                    <li>During the incubation, mixed by vortexing the tube every 2~3 minutes.</li>
 +
                                                                    <li>Cooled the dissolved sample mixture to the room temperature.</li>
 +
                                                                </ol>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                        <h3>DNA Binding</h3>
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol start="2">
 +
                                                                <li>Placed a PG Column in a Collection Tube. Apply the supernatant to the PG Column by decanting or pipetting.</li>
 +
                                                                <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                                <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                        <h3>Wash</h3>
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol start="5">
 +
                                                                <li>Added 400 μl of the Buffer W1 into the PG Column.</li>
 +
                                                                <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                                <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                                <li>Added 600 μl of the Buffer W2 (ethanol added) into the PG Column.</li>
 +
                                                                <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li>
 +
                                                                <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same collection tube.</li>
 +
                                                                <li>Centrifuged at 16,000 xg again for 2 minutes to remove the residual Buffer W2.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                        <h3>Elution</h3>
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol start="12">
 +
                                                                <li>To elute the DNA, placed the PG Column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                                <li>Added 50 μl of the H2O (pH is between 7.0 and 8.5) to the center of each PG
 +
                                                                    Column, let it stand for at least 2 minutes, and centrifuge at 16,000 xg for 2 min.
 +
                                                                </li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div> 
 +
                                </div>
  
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="PCR">
+
                                <div class="row">
−
                                <p class="pcontent">
+
                                    <div class="card-deck">
−
                                    </br></br>
+
                                        <div class="card col-4">
−
                                    <ol start="1">
+
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Plasmid_Extraction">
−
                                         <li>Gently mix the following reaction by pipetting and centrifuge briefly.</li>
+
                                                <div class="post">
−
                                    </ol>
+
                                                    <span class="folded-corner"></span>
−
                                </p>
+
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/wiki-Plasmid extraction.jpg" alt="Extraction">
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="card-body">
 +
                                                    <h5 class="card-title">Plasmid Extraction</h5>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                         </div>
 +
                                        <div class="modal" id="Plasmid_Extraction" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">Plasmid Extraction
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol>
 +
                                                                <li>Transfer 1.4 ml of well-grown bacterial culture to a centrifuge tube.</li>
 +
                                                                <li>Centrifuge the tube at 16,000 xg for 1 minute to pellet the cells and
 +
                                                                    discard the supernatant completely.</li>
 +
                                                                <li>Add 200 µl of FAPD1 Buffer (RNaseA added) to the cell pellet and resuspend
 +
                                                                    the cells completely by pipetting.</li>
 +
                                                                <ul>
 +
                                                                    <li>Make sure that RNaseA has been added into FAPD1 Buffer when first use.</li>
 +
                                                                    <li>No cell pellet should be visible after resuspension of the cells.</li>
 +
                                                                </ul>
 +
                                                                <li>Add 200 µl of FAPD2 Buffer and gently invert the tube 5 ~ 10 times.
 +
                                                                    Incubate
 +
                                                                    the sample mixture at room temperature for 2 ~ 5 minutes to lyse the cells.</li>
 +
                                                                <ul>
 +
                                                                    <li>Do not vortex, vortex may shear genomic DNA. If necessary, continue
 +
                                                                        inverting the tube until the lysate become clear.</li>
 +
                                                                    <li>Make sure the tube transfer to clarify from turbid.</li>
 +
                                                                    <li>Do not proceed with the incubation over 5 minutes.</li>
 +
                                                                </ul>
 +
                                                                <li>Add 300 µl of FAPD3 Buffer and invert the tube 5 ~ 10 times immediately to
 +
                                                                    neutralize the lysate.</li>
 +
                                                                <ul>
 +
                                                                    <li>Invert immediately after adding FAPD3 Buffer will avoid asymmetric precipitation.</li>
 +
                                                                </ul>
 +
                                                                <li>Centrifuge at 16,000 xg for 3 minutess. to clarify the lysate. During
 +
                                                                    centrifugation, place a FAPD Column in a Collection Tube.</li>
 +
                                                                <li>Transfer the supernatant carefully to the FAPD Column and centrifuge at
 +
                                                                    16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.</li>
 +
                                                                <ul>
 +
                                                                    <li>Do not transfer any white pellet into the column.</li>
 +
                                                                </ul>
 +
                           
 +
                                                                <li>Add 400 µl of W1 Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for 1
 +
                                                                    minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.</li>
 +
                                                                <li>Add 600 µl of Wash Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for
 +
                                                                    1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the Collection Tube.</li>
 +
                                                                <ul>
 +
                                                                    <li>Make sure that ethanol (96 ~ 100 %) has been added into Wash Buffer when first use.</li>
 +
                                                                </ul>
 +
                           
 +
                                                                <li>Centrifuge at 16,000 xg for an additional 3 minutes to dry the FAPD Column.</li>
 +
                                                                <ul>
 +
                                                                    <li>Important step! The residual liquid should be removed thoroughly on this step.</li>
 +
                                                                </ul>
 +
                           
 +
                                                                <li>Place the FAPD Column to a new 1.5 ml microcentrifuge tube.</li>
 +
                                                                <li>Add 30 µl of Elution Buffer or ddH2O to the membrane center of the FAPD
 +
                                                                    Column. Stand the column for 3 minute.
 +
                                                                </li>
 +
                                                                <ul>
 +
                                                                    <li>Important step! For effective elution, make sure that the elution solution is
 +
                                                                        dispensed on the membrane center and is absorbed completely.</li>
 +
                                                                    <li>Do not elute the DNA using less than suggested volume (50 µl). It will lower the final yield.</li>
 +
                                                                </ul>
 +
                                                                <li>Centrifuge at 16,000 xg for 3 minute to elute plasmid DNA and store the DNA
 +
                                                                    at -20 ℃.
 +
                                                                </li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
  
 +
                                        <div class="card col-4">
 +
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#DNS_Reductive_Sugar_Measurement">
 +
                                                <div class="post">
 +
                                                    <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/" alt="DNS">
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="card-body">
 +
                                                    <h5 class="card-title">DNS Reductive Sugar Measurement</h5>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                        <div class="modal" id="DNS_Reductive_Sugar_Measurement" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">DNS Reductive Sugar Measurement
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <h3>DNS solution preparation:</h3>
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol>
 +
                                                                <li>Disolve 2.5g of 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) to 150ml double distilled water.</li>
 +
                                                                <li>Heat to solution to 45 degree Celsius and add 4g of NaOH. Stir the solution until it is transparent.</li>
 +
                                                                <li>Add 75g of potassium sodium tartrate and add water to 250 ml.</li>
 +
                                                                <li>Keep the solution without light exposure. The solution can be used after 7 days.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                           
 +
                                                        <h3>Principle:</h3>
 +
                                                        <p class="pblack">
 +
                                                            Under base solution, DNS will turn to brown color while
 +
                                                            reacting with reductive sugar in high temperature. In the specific temperature
 +
                                                            range, the color will have linear relationship with the reductive sugar concentration.
 +
                                                        </p>
 +
                           
 +
                                                        <h3>Calibration:</h3>
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol>
 +
                                                                <li>Prepare glucose or xylose water solution to the following
 +
                                                                        concentration: 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6, 2 g/L.</li>
 +
                                                                <li>Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS solution.</li>
 +
                                                                <li>Heat the sample at 100 degree Celsius for 10mins.</li>
 +
                                                                <li>Cool down the sample with ice to room temperature.</li>
 +
                                                                <li>Measure the optical density of the sample with 540nm light wavelength.</li>
 +
                                                                <li>Draw the graph of sugar concentration with respect to optical density.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                           
 +
                                                        <h3>Calibration results:</h3></br>
 +
                                                        <img class="contentimg" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/f/fa/T--NCKU_Tainan--home_42846829_332575510640801_8298239152197992448_n.png">
 +
                                                        <h3>Measurement:</h3></br>
 +
                                                        <p class="pcontent">
 +
                                                            <ol>
 +
                                                                <li>Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS solution.</li>
 +
                                                                <li>Heat the sample at 100 degree Celsius for 10mins.</li>
 +
                                                                <li>Cool down the sample with ice to room temperature.</li>
 +
                                                                <li>Measure the optical density of the sample with 540nm light wavelength.</li>
 +
                                                                <li>Get the concentration of reductive sugar from the Calibration graph.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
  
 +
                                        <div class="card col-4">
 +
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Long_term_pH_alert_system_measurement">
 +
                                                <div class="post">
 +
                                                    <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/Long term pH sensor measurement.jpg" alt="Long term">
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="card-body">
 +
                                                    <h5 class="card-title">Long term pH alert system measurement</h5>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                        <div class="modal" id="Long_term_pH_alert_system_measurement" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">Long term pH alert system measurement
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <ol>
 +
                                                            <li>Preculture the bacteria o/n in LB, and prepared 8 different
 +
                                                                (pH4,4.25,4.5,4.75,5,5.5,6,7) pH value of M9 buffer.</li>
 +
                                                            <li>Add 1/100 of the bacteria in 20 ml of different pH value of M9 buffer with
 +
                                                                1/1000 chloramphenicol.</li>
 +
                                                            <li>Culture the bacteria in the incubator in 37℃for 24 hr.</li>
 +
                                                            <li>Measure the O.D. value (595 nm) and the fluorescence value (485-535nm ) at every 1 hr , within 24 hr.</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 +
                                </div>
  
−
                                 <table class="card card-body PCR1">
+
                                 <div class="row">
−
                                    　<tr>
+
                                    <div class="card-deck">
−
                                        　<th></th>
+
                                        <div class="card col-4">
−
                                         　<th>20 μl system</th>
+
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Short_term">
−
                                        <th>50 μl system</th>
+
                                                <div class="post">
−
                                    </tr>
+
                                                    <span class="folded-corner"></span>
 +
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/Short term pH sensor measurement.jpg" alt="Short term">
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="card-body">
 +
                                                    <h5 class="card-title">Short term pH alert systen measurement</h5>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                         </div>
 +
                                        <div class="modal" id="Short_term" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">Short term pH alert systen measurement
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <ol>
 +
                                                            <li>Preculture the bacteria o/n in LB, and prepared 8 different
 +
                                                                (pH4,4.25,4.5,4.75,5,5.5,6,7) pH value of M9 buffer.</li>
 +
                                                            <li>Culture the bacteria in 6 ml LB with 1/1000 chloramphenicol to log phase (about 1.5-2hr)</li></br>
 +
                                                            <li>Divide 6 ml of bacteria into 8 eppendorfs, and centrifuged them at 1300 rpm
 +
                                                                for 1 mins in 37 ℃, then discard the supernatant completely.</li>
 +
                                                            <li>Add 700 μl per different pH value of M9 buffer into 8 different eppendorfs,
 +
                                                                respectively . And resuspend the cells completely by pipetting.</li>
 +
                                                            <li>Add 200 μl of bacteria in 96 well (This step need triple repetition.)</li>
 +
                                                            <li>Measure the O.D.595 nm at the first and the last time point , and the
 +
                                                                fluorescence value (485-535nm ) at every 180 sec, within 30 mins.</li>
 +
                                                        </ol>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
  
−
                                    <tr>
+
                                        <div class="card col-4">
−
                                        　<td>Template</td>
+
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Carbonic_Anhydrase_Activity_Assay">
−
                                        　<td>12～20 ng</td>
+
                                                <div class="post">
−
                                         <td>30～50 ng</td>
+
                                                    <span class="folded-corner"></span>
−
                                    </tr>
+
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/Carbonic anhydrase activity assay.jpg" alt="assay">
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="card-body">
 +
                                                    <h5 class="card-title">Carbonic Anhydrase Activity Assay</h5>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                         </div>
 +
                                        <div class="modal" id="Carbonic_Anhydrase_Activity_Assay" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">Carbonic Anhydrase Activity Assay
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <h3>Materials:</h3>
 +
                                                        <p>
 +
                                                            pH meter, enzyme samples, magnetic stirrer, saturated CO2 solution, 20 mM Tris-HCl
 +
                                                            buffer (pH8.3), 20mL borosilicate glass vial
 +
                                                        </p>
 +
                                                        <h3>Method:</h3>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li>Saturated CO2 solution preparation</li>
 +
                                                            <p>Dissolve gaseous CO2 into deionized water (on ice) until it is saturated. (At least 30 min)</p>
 +
                                                            <li>20 mM Tris HCl buffer (pH8.3) preparation</li>
 +
                                                                <ol>
 +
                                                                    <li>Dissolve 121.14 g Tris in 800 ml deionized water.</li>
 +
                                                                    <li>Add a pH meter into the solution to observe the pH.</li>
 +
                                                                    <li>Slowly add concentrated hydrochloric acid (HCl) solution to reduce the pH to
 +
                                                                        8.3. Be careful not to add too much at a time, since the pH will change rapidly.</li>
 +
                                                                    <li>Once the desired pH has been reached, top up the solution to 1 L using deionized water.</li>
 +
                                                                </ol>
 +
                                                            <li>Performing Blank Reaction</li>
 +
                                                            <ol start="5">
 +
                                                                <li>Add 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM, pH8.3) buffer into a 20 mL borosilicate
 +
                                                                    glass vial with further incubation at 0 °C with stirring.</li>
 +
                                                                <li>Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated solution immediately into the vial.</li>
 +
                                                                <li>Record the time course, T<sub>0</sub> (in sec) of pH decrease from 8.3 to
 +
                                                                    6.3. The pH meter must be preset to 0°C and calibrated.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                            <li>Performing Test-Sample Reaction</li>
 +
                                                            <ol start="8">
 +
                                                                <li>Mix 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM, pH8.3) buffer and 0.2 mL enzyme, transfer
 +
                                                                    the mixture to a 20 mL borosilicate glass vial with further incubation at 0 °C with stirring.</li>
 +
                                                                <li>Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated solution immediately into the vial.</li>
 +
                                                                <li>Record the time course, T (in sec) of pH decrease from 8.3 to 6.3. The pH
 +
                                                                    meter must be preset to 0°C and calibrated.</li>
 +
                                                                <li>Calculate CA activity using a Wilbur–Anderson unit (WAU) per milliliter of sample.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                        <h3>Calculation:</h3>
 +
                                                        <div>
 +
                                                            <p>
 +
                                                                Units/ml of enzyme = (T<sub>0 Average</sub> - T<sub>Average</sub> ) (df) / (T<sub>Average</sub> )(E)
 +
                                                            </p>
 +
                                                        </div>
 +
                                                        <p>T = Time (in seconds) required for pH to change from 8.3 to 6.3 as per Unit Definition</p>
 +
                                                        <p>df = dilution factor</p>
 +
                                                        <p>E= volume (in milliliters) of enzyme used</p>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
  
−
                                    　<tr>
+
                                        <div class="card col-4">
−
                                        　<td>Forward primer</td>
+
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Competent_Cell_Preparation">
−
                                         　<td>1.0 μl</td>
+
                                                <div class="post">
−
                                        <td>2.5 μl</td>
+
                                                    <span class="folded-corner"></span>
−
                                     </tr>
+
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/" alt="Total solution">
 +
                                                </div>
 +
                                                <div class="card-body">
 +
                                                    <h5 class="card-title">Competent Cell Preparation</h5>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                         </div>
 +
                                        <div class="modal" id="Competent_Cell_Preparation" tabindex="-1" role="dialog">
 +
                                            <div class="modal-dialog" role="document">
 +
                                                <div class="modal-content">
 +
                                                    <div class="modal-header">Competent Cell Preparation
 +
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
 +
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
 +
                                                        </button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-body">
 +
                                                        <p>For <i>E. coli</i> DH5α,BL21(DE3) and W3100(DE3) competent cell
 +
                                                            <ol>
 +
                                                                <li>Streak out wild type <i>E. coli</i> on a plate (LB plate without antibiotics) overnight
 +
                                                                    and pick one colony into 3 ml of media (LB) and grow overnight.</li>
 +
                                                                <li>Transfer 0.4 ml of starter culture into 40 ml of fresh LB and grow culture at 37 ℃.</li>
 +
                                                                <li>When the OD600 nm up to 0.35, put the cells on ice immediately.</li>
 +
                                                                <li>Spin the cells at 4℃ for 10 minutes at 4000 rpm.</li>
 +
                                                                <li>Suspend the pellet on ice carefully with 16 ml chilly Transformation Buffer 1(TFB1).</li>
 +
                                                                <li>Leave nicely suspended bugs on ice for 10 minutes.</li>
 +
                                                                <li>Spin the cells at 4℃ for 10 min. at 4000 rpm.</li>
 +
                                                                <li>Suspend the pellet on ice with 1.6 ml of Transformation Buffer 2 (TFB2).</li>
 +
                                                                <li>Leave on immediately on ice for 30 minutes.</li>
 +
                                                                <li>Aliquot 100 μl into 1.5 ml centrifuge tubes and snap freeze immediately with liquid nitrogen.</li>
 +
                                                                <li>Store the frozen cells in the -80℃ freezer.</li>
 +
                                                            </ol>
 +
                                                        </p>
 +
                                                    </div>
 +
                                                    <div class="modal-footer">
 +
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
 +
                                                    </div>
 +
                                                </div>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                     </div>
 +
                                </div>  
  
−
                                    <tr>
+
                                 <div class="row">
−
                                        　<td>Reverse primer</td>
+
                                     <div class="card-deck">
−
                                        　<td>1.0 μl</td>
+
                                         <div class="card col-4">
−
                                        <td>2.5 μl</td>
+
                                            <div class="action-button" type="button" class="btn btn-primary" data-toggle="modal" data-target="#Total_Solution">
−
                                    </tr>
+
                                                <div class="post">
−
 
+
                                                    <span class="folded-corner"></span>
−
                                    　<tr>
+
                                                    <img class="card-img-top" src="picture/Carbonic anhydrase activity assay.jpg" alt="Total solution">
−
                                        　<td>dNTP</td>
+
                                                </div>
−
                                        　<td>1.6 μl</td>
+
                                                <div class="card-body">
−
                                        <td>4.0 μl</td>
+
                                                    <h5 class="card-title">Total Solution</h5>
−
                                    </tr>
+
                                                </div>
−
 
+
                                            </div>
−
                                    <tr>
+
                                         </div>
−
                                        　<td>10x Buffer</td>
+
                                         <div class="modal" id="Total_Solution" tabindex="-1" role="dialog">
−
                                        　<td>2.0 μl</td>
+
                                             <div class="modal-dialog" role="document">
−
                                        <td>5.0 μl</td>
+
                                                <div class="modal-content">
−
                                    </tr>
+
                                                    <div class="modal-header">Total Solution
−
 
+
                                                        <button type="button" class="close" data-dismiss="modal" aria-label="Close">
−
                                 </table>
+
                                                            <span aria-hidden="true">&times;</span>
−
                                <p class="pcontent"></br> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Program of KOD DNA
+
                                                        </button>
−
                                     polymerase</p>
+
                                                    </div>
−
                                <table class="card card-body PCR2">
+
                                                    <div class="modal-body">
−
                                    　<tr>
+
                                                        <ol>
−
                                         　<th>Temperature</th>
+
                                                            <li>Preculture the bacteria overnight by picking up a colony in 4ml LB with antibiotic.</li>
−
                                        　<th>Time</th>
+
                                                            <li>Culture the bacteria in 30 ml LB by adding 1/100 of precultured broth, 1/2000
−
                                        <th></th>
+
                                                                kanamycin, 1/4000 chloramphenicol to log phase(about 3 hr).</li>
−
                                    </tr>
+
                                                            <li>Centrifuge them in 22℃ ,3200xg for 5 minutes , then refresh by the M9 medium with 4%xylose and 0.1%LB.</li>
−
 
+
                                                            <li>Culture the bacteria for 24 hr in both O<sub>2</sub> and 5%CO<sub>2</sub> incubator, and test the O.D. value at every 6 hours.</li>
−
                                    <tr>
+
                                                        </ol>
−
                                        　<td>94 ℃</td>
+
                                                    </div>
−
                                        　<td>3 min.</td>
+
                                                    <div class="modal-footer">
−
                                        <td></td>
+
                                                        <button type="button" class="btn btn-secondary" data-dismiss="modal">Close</button>
−
                                    </tr>
+
                                                    </div>
−
 
+
                                                </div>
−
                                    　<tr>
+
                                            </div>
−
                                        　<td>94 ℃</br>(Denaturation)</td>
+
                                         </div>
−
                                        　<td>40 sec</td>
+
                                         <div class="card col-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
−
                                        <td rowspan="2">25～30 cycles</td>
+
                                        <div class="card col-4 disappear" style="background-color: #272625; border-style: none;"></div>
−
                                    </tr>
+
                                     </div>
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>57.5 ℃</br>(Annealing)</td>
+
−
                                        　<td>30 sec</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<td>72 ℃</br>(Extension)</td>
+
−
                                        　<td>Depend on sequence size</br>(2 kbp/min. for Taq)</td>
+
−
                                        <td></td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>72 ℃</td>
+
−
                                        　<td>5 min.</td>
+
−
                                        <td></td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>4 ℃</td>
+
−
                                        　<td>∞</td>
+
−
                                        <td></td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                </table>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol start="2">
+
−
                                        <li>Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.</li>
+
−
                                        </br>
+
−
                                        <li>Gel purification of the target size.</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                    </br>
+
−
                                </p>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
                        <div id="list-item-2">
+
−
                            </br></br></br></br>
+
−
                            <div class="row">
+
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Plasmid_Construction" role="button"
+
−
                                    aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                    Plasmid Construction
+
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                                </a>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="Plasmid_Construction">
+
−
                                </br></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol>
+
−
                                        <li>Digestion (vector)</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
                                <table class="card card-body PC1">
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<th>Plasmid</th>
+
−
                                        　<th>200 ng</th>
+
−
                                        <th>1000 ng</th>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>EcoRI / SpeI</td>
+
−
                                        　<td>0.2 μl</td>
+
−
                                        <td>1 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<td>XbaI / PstI</td>
+
−
                                        　<td>0.2 μl</td>
+
−
                                        <td>1 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>CutSmart Buffer</td>
+
−
                                        　<td>2 μl</td>
+
−
                                        <td>5 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<td>ddH2O</td>
+
−
                                        　<td>Up to 20 μl</td>
+
−
                                        <td>Up to 50 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
+
−
                                        　<td></td>
+
−
                                        <td></td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                </table>
+
−
 
+
−
                                </br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol start="2">
+
−
                                        <li>Digestion (insert)</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
                                <table class="card card-body PC1">
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<th>Plasmid</th>
+
−
                                        　<th>200 ng</th>
+
−
                                        <th>1000 ng</th>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>EcoRI / XbaI</td>
+
−
                                        　<td>0.2 μl</td>
+
−
                                        <td>1 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<td>SpeI / PstI</td>
+
−
                                        　<td>0.2 μl</td>
+
−
                                        <td>1 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>CutSmart Buffer</td>
+
−
                                        　<td>2 μl</td>
+
−
                                        <td>5 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<td>ddH2O</td>
+
−
                                        　<td>Up to 20 μl</td>
+
−
                                        <td>Up to 50 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>Digestion at 37℃ for 2.5hr.</td>
+
−
                                        　<td></td>
+
−
                                        <td></td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                </table>
+
−
 
+
−
                                </br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol start="3">
+
−
                                        <li>Confirm the size of the digested product by gel electrophoresis.</li>
+
−
                                        </br>
+
−
                                        <li>Gel purification of the target size.</li>
+
−
                                        </br>
+
−
                                        <li>Ligation</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
                                <table class="card card-body PC2">
+
−
 
+
−
                                    　<tr>
+
−
                                        　<td>Vector (2 kbp)</td>
+
−
                                        　<td rowspan="2">molar ratio = 1:3</br>(can up to 1:10 depending on the
+
−
                                            DNA sizes)</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>Insert (1.5 kbp)</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>Quick Ligase Reaction Buffer (2X)*</td>
+
−
                                        <td>10 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>Quick Ligase</td>
+
−
                                        <td>1 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                    <tr>
+
−
                                        　<td>ddH2O</td>
+
−
                                        <td>Up to 20 μl</td>
+
−
                                    </tr>
+
−
 
+
−
                                </table>
+
−
 
+
−
                                </br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol start="6">
+
−
                                        <li>Transform the product by heat shock.</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
 
+
−
 
+
−
                            </div>
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
 
+
−
                        <div id="list-item-3">
+
−
                            </br></br></br></br>
+
−
                            <div class="row">
+
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Extraction" role="button"
+
−
                                    aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                    PCR Clean-Up & Gel Extraction
+
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                                </a>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="Extraction">
+
−
 
+
−
                                </br></br>
+
−
                                <h3>Gel Dissociation</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol>
+
−
                                         <li>Gel Extraction</li>
+
−
                                         <ol type="a">
+
−
                                            <li>Excised the DNA fragment from the agarose gel.</li></br>
+
−
                                            <li>Transferred up to 300 mg of the gel slice to a 1.5 ml microcentrifuge
+
−
                                                tube.</li></br>
+
−
                                            <li>Added 500 μl of the Gel/PCR Bufffer to the sample and mixed by vortex.</li></br>
+
−
                                            <li>Incubate at 55~60℃ for 10 minutes (or until the gel slice has
+
−
                                                completely dissolved).</li> </br>
+
−
                                            <li>During the incubation, mixed by vortexing the tube every 2~3 minutes.</li></br>
+
−
                                            <li>Cooled the dissolved sample mixture to the room temperature.</li>
+
−
                                        </ol>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
                                <h3>DNA Binding</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol start="2">
+
−
                                        <li>Placed a PG Column in a Collection Tube. Apply the supernatant to the PG
+
−
                                            Column by decanting or pipetting.</li></br>
+
−
                                        <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li></br>
+
−
                                        <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same
+
−
                                            collection tube.</li></br>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
                                <h3>Wash</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol start="5">
+
−
                                        <li>Added 400 μl of the Buffer W1 into the PG Column.</li></br>
+
−
                                        <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li></br>
+
−
                                        <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same
+
−
                                            collection tube.</li></br>
+
−
                                        <li>Added 600 μl of the Buffer W2 (ethanol added) into the PG Column.</li></br>
+
−
                                        <li>Centrifuged at 16,000 xg for 30 seconds.</li></br>
+
−
                                        <li>Discarded the flow-through and place the PG Column back into the same
+
−
                                            collection tube.</li></br>
+
−
                                        <li>Centrifuged at 16,000 xg again for 2 minutes to remove the residual Buffer
+
−
                                            W2.</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
                                <h3>Elution</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol start="12">
+
−
                                        <li>To elute the DNA, placed the PG Column in a clean 1.5 ml
+
−
                                             microcentrifuge
+
−
                                            tube.</li></br>
+
−
                                        <li>Added 50 μl of the H2O (pH is between 7.0 and 8.5) to the center of
+
−
                                            each PG
+
−
                                            Column, let it stand for at least 2 minutes, and centrifuge at 16,000 xg
+
−
                                            for 2
+
−
                                            min.</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        </br></br></br></br>
+
−
                        <div class="row">
+
−
                            <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Preparation" role="button"
+
−
                                aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                Competent Cell Preparation
+
−
                                <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                            </a>
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
                        <div class="collapse multi-collapse" id="Preparation">
+
−
                            <p class="pcontent"></br></br>
+
−
                                For E. coli DH5α,BL21(DE3) and W3100(DE3) competent cell
+
−
                                <ol>
+
−
                                    <li>Streak out wild type E. coli on a plate (LB plate without antibiotics)
+
−
                                        overnight
+
−
                                        and pick one colony into 3 ml of media (LB) and grow overnight.</li></br>
+
−
                                    <li>Transfer 0.4 ml of starter culture into 40 ml of fresh LB and grow culture at
+
−
                                        37
+
−
                                        ℃.</li></br>
+
−
                                    <li>When the OD600 nm up to 0.35, put the cells on ice immediately.</li></br>
+
−
                                    <li>Spin the cells at 4℃for 10 minutes at 4000 rpm.</li></br>
+
−
                                    <li>Suspend the pellet on ice carefully with 16 ml chilly Transformation Buffer
+
−
                                        1(TFB1).</li></br>
+
−
                                    <li>Leave nicely suspended bugs on ice for 10 minutes.</li></br>
+
−
                                    <li>Spin the cells at 4℃ for 10 min. at 4000 rpm.</li></br>
+
−
                                    <li>Suspend the pellet on ice with 1.6 ml of Transformation Buffer 2 (TFB2).</li></br>
+
−
                                    <li>Leave on immediately on ice for 30 minutes.</li></br>
+
−
                                    <li>Aliquot 100 μl into 1.5 ml centrifuge tubes and snap freeze immediately with
+
−
                                        liquid nitrogen.</li></br>
+
−
                                    <li>Store the frozen cells in the -80℃ freezer.</li></br>
+
−
                                </ol>
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
                        <div id="list-item-4">
+
−
 
+
−
                            </br></br></br></br>
+
−
                            <div class="row">
+
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#Plasmid_Extraction" role="button"
+
−
                                    aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                    Plasmid Extraction
+
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                                </a>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="Plasmid_Extraction">
+
−
                                <p class="pcontent"></br></br>
+
−
                                    <ol>
+
−
                                        <li>Transfer 1.4 ml of well-grown bacterial culture to
+
−
                                            a centrifuge tube.</li></br>
+
−
                                        <li>Centrifuge the tube at 16,000 xg for 1 minute to pellet the cells and
+
−
                                            discard the supernatant completely.</li></br>
+
−
                                        <li>Add 200 µl of FAPD1 Buffer (RNaseA added) to the cell pellet and resuspend
+
−
                                            the cells completely by pipetting.</li></br>
+
−
 
+
−
                                        <ul>
+
−
                                            <li>Make sure that RNaseA has been added into FAPD1 Buffer when first use.</li>
+
−
                                            <li>No cell pellet should be visible after resuspension of the cells.</li>
+
−
 
+
−
                                        </ul></br>
+
−
 
+
−
                                        <li>Add 200 µl of FAPD2 Buffer and gently invert the tube 5 ~ 10 times.
+
−
                                            Incubate
+
−
                                            the sample mixture at room temperature for 2 ~ 5 minutes to lyse the cells.</li></br>
+
−
 
+
−
                                        <ul>
+
−
                                            <li>Do not vortex, vortex may shear genomic DNA. If necessary, continue
+
−
                                                inverting the tube until the lysate become clear.</li>
+
−
                                            <li>Make sure the tube transfer to clarify from turbid.</li>
+
−
                                            <li>Do not proceed with the incubation over 5 minutes.</li>
+
−
                                        </ul></br>
+
−
 
+
−
                                        <li>Add 300 µl of FAPD3 Buffer and invert the tube 5 ~ 10 times immediately to
+
−
                                            neutralize the lysate.</li></br>
+
−
 
+
−
                                        <ul>
+
−
                                            <li>Invert immediately after adding FAPD3 Buffer will avoid asymmetric
+
−
                                                precipitation.</li>
+
−
                                        </ul></br>
+
−
 
+
−
                                        <li>Centrifuge at 16,000 xg for 3 minutess. to clarify the lysate. During
+
−
                                            centrifugation, place a FAPD Column in a Collection Tube.</li></br>
+
−
                                        <li>Transfer the supernatant carefully to the FAPD Column and centrifuge at
+
−
                                            16,000 xg for 1 minute. Discard the flow-through and place the column back
+
−
                                            to
+
−
                                            the Collection Tube.</li></br>
+
−
 
+
−
                                        <ul>
+
−
                                            <li>Do not transfer any white pellet into the column.</li>
+
−
                                        </ul></br>
+
−
 
+
−
                                        <li>Add 400 µl of W1 Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg for
+
−
                                            1
+
−
                                            minute. Discard the flow-through and place the column back to the
+
−
                                            Collection
+
−
                                            Tube.</li></br>
+
−
                                        <li>Add 600 µl of Wash Buffer to the FAPD Column and centrifuge at 16,000 xg
+
−
                                            for
+
−
                                            1 minute. Discard the flow-through and place the column back to the
+
−
                                            Collection
+
−
                                            Tube.</li></br>
+
−
 
+
−
                                        <ul>
+
−
                                            <li>Make sure that ethanol (96 ~ 100 %) has been added into Wash Buffer
+
−
                                                when
+
−
                                                first use.</li>
+
−
                                        </ul></br>
+
−
 
+
−
                                        <li>Centrifuge at 16,000 xg for an additional 3 minutes to dry the FAPD
+
−
                                            Column.</li></br>
+
−
 
+
−
                                        <ul>
+
−
                                            <li>Important step! The residual liquid should be removed thoroughly on
+
−
                                                this
+
−
                                                step.</li>
+
−
                                        </ul></br>
+
−
 
+
−
                                        <li>Place the FAPD Column to a new 1.5 ml microcentrifuge tube.</li></br>
+
−
                                        <li>Add 30 µl of Elution Buffer or ddH2O to the membrane center of the FAPD
+
−
                                            Column. Stand the column for 3 minute.</li></br>
+
−
                                        <ul>
+
−
                                            <li>Important step! For effective elution, make sure that the elution
+
−
                                                solution is
+
−
                                                dispensed on the membrane center and is absorbed completely.</li>
+
−
                                            <li>Do not elute the DNA using less than suggested volume (50 µl). It will
+
−
                                                lower the final yield.</li>
+
−
                                        </ul></br>
+
−
 
+
−
                                        <li>Centrifuge at 16,000 xg for 3 minute to elute plasmid DNA and store the DNA
+
−
                                            at -20 ℃.</li>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
 
+
−
 
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
                        <div id="list-item-5">
+
−
 
+
−
                            </br></br></br></br>
+
−
                            <div class="row">
+
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#DNS" role="button" aria-expanded="false"
+
−
                                    aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                    DNS Reductive Sugar Measurement
+
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                                </a>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="DNS">
+
−
                                </br>
+
−
                                <h3>DNS solution preparation:</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol>
+
−
                                        <li>Disolve 2.5g of 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) to 150ml
+
−
                                            double distilled water.</li></br>
+
−
                                        <li>Heat to solution to 45 degree Celsius and add 4g of NaOH. Stir the solution
+
−
                                            until it is transparent.</li></br>
+
−
                                        <li>Add 75g of potassium sodium tartrate and add water to 250 ml.</li></br>
+
−
                                        <li>Keep the solution without light exposure. The solution can be used after 7
+
−
                                            days.</li></br>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
                                <h3>Principle:</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    Under base solution, DNS will turn to brown color while
+
−
                                    reacting with reductive sugar in high temperature. In the specific temperature
+
−
                                    range, the color will have linear relationship with the reductive sugar
+
−
                                    concentration.</br></br></p>
+
−
 
+
−
                                <h3>Calibration:</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
 
+
−
                                    <ol>
+
−
                                        <li>Prepare glucose or xylose water solution to the following
+
−
                                            concentration: 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6, 2 g/L.</li></br>
+
−
                                        <li>Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS solution.</li></br>
+
−
                                        <li>Heat the sample at 100 degree Celsius for 10mins.</li></br>
+
−
                                        <li>Cool down the sample with ice to room temperature.</li></br>
+
−
                                        <li>Measure the optical density of the sample with 540nm light wavelength.</li></br>
+
−
                                        <li>Draw the graph of sugar concentration with respect to optical density.</li></br>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
                                <h3>Calibration results:</h3></br>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                <img class="contentimg" src="https://static.igem.org/mediawiki/2018/f/fa/T--NCKU_Tainan--home_42846829_332575510640801_8298239152197992448_n.png"></br></br>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                <h3>Measurement:</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    <ol>
+
−
                                        <li>Take 200 ul of sample, add 200 ul of DNS solution.</li></br>
+
−
                                        <li>Heat the sample at 100 degree Celsius for 10mins.</li></br>
+
−
                                        <li>Cool down the sample with ice to room temperature.</li></br>
+
−
                                        <li>Measure the optical density of the sample with 540nm light wavelength.</li></br>
+
−
                                        <li>Get the concentration of reductive sugar from the Calibration graph.</li></br>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </p>
+
−
                            </div>
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
                        <div id="list-item-6">
+
−
 
+
−
                            </br></br></br></br>
+
−
                            <div class="row">
+
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#pH24" role="button"
+
−
                                    aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                    pH24
+
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                                </a>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="PH24">
+
−
                                </br></br>
+
−
                                <ol>
+
−
                                    <li>Preculture the bacteria o/n in LB, and prepared 8 different
+
−
                                        (pH4,4.25,4.5,4.75,5,5.5,6,7) pH value of M9 buffer.</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Add 1/100 of the bacteria in 20 ml of different pH value of M9 buffer with
+
−
                                        1/1000 chloramphenicol.</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Culture the bacteria in the incubator in 37℃for 24 hr.</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Measure the O.D. value (595 nm) and the fluorescence value (485-535nm ) at
+
−
                                        every
+
−
                                        1 hr , within 24 hr.</li></br>
+
−
                                </ol>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
                        <div id="list-item-7">
+
−
 
+
−
                            </br></br></br></br>
+
−
                            <div class="row">
+
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#pH30" role="button"
+
−
                                    aria-expanded="false" aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                    pH30
+
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                                </a>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="pH30">
+
−
                                </br></br>
+
−
                                <ol>
+
−
                                    <li>Preculture the bacteria o/n in LB, and prepared 8 different
+
−
                                         (pH4,4.25,4.5,4.75,5,5.5,6,7) pH value of M9 buffer.</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Culture the bacteria in 6 ml LB with 1/1000 chloramphenicol to log phase (about
+
−
                                         1.5-2hr)</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Divide 6 ml of bacteria into 8 eppendorfs, and centrifuged them at 1300 rpm
+
−
                                        for 1 mins in 37 ℃, then discard the supernatant completely.</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Add 700 μl per different pH value of M9 buffer into 8 different eppendorfs,
+
−
                                        respectively . And resuspend the cells completely by pipetting.</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Add 200 μl of bacteria in 96 well (This step need triple repetition.)</li></br>
+
−
 
+
−
                                    <li>Measure the O.D.595 nm at the first and the last time point , and the
+
−
                                        fluorescence value (485-535nm ) at every 180 sec, within 30 mins.</li></br>
+
−
                                </ol>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
 
+
−
                        <div id="list-item-8">
+
−
 
+
−
                            </br></br></br></br>
+
−
                            <div class="row">
+
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#COO" role="button" aria-expanded="false"
+
−
                                    aria-controls="multiCollapseExample1">
+
−
                                    Carbonic Anhydrase Activity Assay
+
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
+
−
                                </a>
+
−
                            </div>
+
−
 
+
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="COO">
+
−
                                </br></br>
+
−
                                <h3>Materials:</h3></br>
+
−
                                <p class="pcontent">
+
−
                                    pH meter, enzyme samples, magnetic stirrer, saturated CO2 solution, 20 mM Tris-HCl
+
−
                                    buffer (pH8.3), 20mL borosilicate glass vial
+
−
                                </p>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                <h3>Method:</h3></br>
+
−
 
+
−
                                <ul>
+
−
                                    <li>Saturated CO2 solution preparation</li></br>
+
−
                                    <p class="pcontent">Dissolve gaseous CO2 into deionized water (on ice) until it
+
−
                                        is saturated. (At least
+
−
                                        30 min)</p></br></br>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                    <li>20 mM Tris HCl buffer (pH8.3) preparation</li></br></br>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                    <ol>
+
−
                                        <li>Dissolve 121.14 g Tris in 800 ml deionized water.</li></br>
+
−
                                        <li>Add a pH meter into the solution to observe the pH.</li></br>
+
−
                                        <li>Slowly add concentrated hydrochloric acid (HCl) solution to reduce the pH
+
−
                                            to
+
−
                                            8.3. Be careful not to add too much at a time, since the pH will change
+
−
                                            rapidly.</li></br>
+
−
                                        <li>Once the desired pH has been reached, top up the solution to 1 L using
+
−
                                            deionized water.</li></br>
+
−
                                    </ol>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                    <li>Performing Blank Reaction</li></br></br>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                    <ol start="5">
+
−
                                        <li>Add 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM, pH8.3) buffer into a 20 mL borosilicate
+
−
                                            glass vial with further incubation at 0 °C with stirring.</li></br>
+
−
                                        <li>Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated solution immediately into the vial.</li></br>
+
−
                                        <li>Record the time course, T<sub>0</sub> (in sec) of pH decrease from 8.3 to
+
−
                                            6.3. The pH meter must be preset to 0°C and calibrated.</li></br>
+
−
                                    </ol>
+
−
 
+
−
 
+
−
                                    <li>Performing Test-Sample Reaction</li></br></br>
+
−
 
+
−
                                    <ol start="8">
+
−
                                        <li>Mix 9 mL ice-cold Tris−HCl (20 mM, pH8.3) buffer and 0.2 mL enzyme,
+
−
                                            transfer
+
−
                                            the mixture to a 20 mL borosilicate glass vial with further incubation at 0
+
−
                                            °C
+
−
                                            with stirring.</li></br>
+
−
                                        <li>Add 6 mL of ice-cold CO2-saturated solution immediately into the vial.</li></br>
+
−
                                        <li>Record the time course, T (in sec) of pH decrease from 8.3 to 6.3. The pH
+
−
                                            meter must be preset to 0°C and calibrated.</li></br>
+
−
                                        <li>Calculate CA activity using a Wilbur–Anderson unit (WAU) per milliliter of
+
−
                                            sample.</li></br>
+
−
                                    </ol>
+
−
                                </ul>
+
−
 
+
−
                                <h3>Calculation:</h3></br>
+
−
 
+
−
                                <div style="text-align: center !importamt" ;>
+
−
                                    <p class="pcontent">
+
−
                                        Units/ml of enzyme= (T<sub>0 Average</sub> - T<sub>Average</sub> ) (df) / (T<sub>Average</sub>
+
−
                                        )(E)
+
−
                                     </p>
+
 
                                 </div>
 
                                 </div>
−
 
−
                                <p class="pcontent">
 
−
                                    T = Time (in seconds) required for pH to change from 8.3 to 6.3 as per Unit
 
−
                                    Definition</br>
 
−
                                    df = dilution factor</br>
 
−
                                    E= volume (in milliliters) of enzyme used</br>
 
−
                                </p>
 
−
 
−
 
 
                             </div>
 
                             </div>
−
 
 
                         </div>
 
                         </div>
−
 
−
                        <div id="list-item-9">
 
−
 
−
                            </br></br></br></br>
 
−
                            <div class="row">
 
−
                                <a class="btn col-md-12" data-toggle="collapse" href="#TLT" role="button" aria-expanded="false"
 
−
                                    aria-controls="multiCollapseExample1">
 
−
                                    Total Solution
 
−
                                    <i class="fa fa-arrow-down fa-10" aria-hidden="true"></i>
 
−
                                </a>
 
−
                            </div>
 
−
 
−
                            <div class="collapse multi-collapse" id="TLT">
 
−
                                </br></br>
 
−
                                <p class="pcontent">
 
−
                                    <ol>
 
−
                                        <li>Preculture the bacteria overnight by picking up a colony in 4ml LB with
 
−
                                            antibiotic.</li></br>
 
−
 
−
                                        <li>Culture the bacteria in 30 ml LB by adding 1/100 of precultured broth , 1/2000
 
−
                                            kanamycin, 1/4000 chloramphenicol to log phase( about 3 hr).</li></br>
 
−
 
−
                                        <li>Centrifuge them in 22℃ ,3200xg for 5 minutes , then refresh by the M9
 
−
                                            medium with 4%xylose and 0.1%LB.</li></br>
 
−
 
−
                                        <li>Culture the bacteria for 24 hr in both O2 and 5%CO2 incubator , and test
 
−
                                            the O.D. value at every 6 hours.</li></br>
 
−
                                    </ol>
 
−
                                </p>
 
−
                            </div>
 
−
 
−
                        </div>
 
−
 
−
                        </br></br></br></br>
 
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
−
         </div>
+
         </div>      
−
    </div>
+
−
 
+
−
    <script>
+
−
        $(document).ready(function () {
+
−
            $(window).scroll(function () {
+
−
                if ($(this).scrollTop() >= 100) {
+
−
                    var position = $("#sidelist").position();
+
−
                    if (position == undefined) {} else {
+
−
                        $('#sidelist').css({
+
−
                            "position": "fixed",
+
−
                            "top": "145px",
+
−
                            "margin-top": "0px"
+
−
                        });
+
−
                    }
+
−
                } else {
+
−
                    $('#sidelist').removeAttr('style');
+
−
                }
+
−
            });
+
−
            $(function () {
+
−
                $('i.fa-arrow-up').click(function () {
+
−
                    $('html, body').animate({
+
−
                        scrollTop: 0
+
−
                    }, 600);
+
−
                    return false;
+
−
                });
+
−
            });
+
−
        });
+
−
    </script>
+
−
 
+
 
     <script src="https://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/js/frame/T--NCKU_Tainan--jquery-1_12_4_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 
     <script src="https://2017.igem.org/Team:NCKU_Tainan/js/frame/T--NCKU_Tainan--jquery-1_12_4_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 
     <script src="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/js/bootstrap_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>
 
     <script src="https://2018.igem.org/Template:NCKU_Tainan/js/bootstrap_min_js?action=raw&amp;ctype=text/javascript"></script>

Revision as of 15:21, 30 September 2018

Protocol

PCR
PCR
Plasmid Construction
Plasmid Construction
Clean Up
PCR Clean-Up & Gel Extraction
Extraction
Plasmid Extraction
DNS
DNS Reductive Sugar Measurement
Long term
Long term pH alert system measurement
Short term
Short term pH alert systen measurement
assay
Carbonic Anhydrase Activity Assay
Total solution
Competent Cell Preparation
Total solution
Total Solution
Follow us
Contact us

igem.ncku.tainan@gmail.com
No.1, Daxue Rd., East Dist., Tainan City 701, Taiwan (R.O.C.)