Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Protocols/CellBio"

Line 43: Line 43:
 
         <div class="block full" id="molbio_0" style="display:flex;flex-flow: row wrap;justify-content:center;margin:auto;">
 
         <div class="block full" id="molbio_0" style="display:flex;flex-flow: row wrap;justify-content:center;margin:auto;">
  
−
             <h2 style="order:1;">DNA Assembly and microbiology</h2>
+
             <h2 style="order:1;">Molecular Biology: general protocols</h2>
  
−
             <p style="text-indent:0px;order:2;margin:2em;">   </p>                           
+
             <p style="text-indent:0px;order:2;margin:2em;">Here we present the basic molecular biology methods we used throughout the project to amplify our plasmids, linearize them and insert our sequences, retrieve them from bacteria and express proteins. </p>                           
  
  
Line 56: Line 56:
  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Agarose Gel Preparation</p>
+
                     <p>Bacteria transformation</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
−
 
−
 
  
 
             <div class="vignette" id="vign_1001">
 
             <div class="vignette" id="vign_1001">
Line 70: Line 68:
 
                  
 
                  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Bacterial Stock</p>
+
                     <p>Liquid culture</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
Line 82: Line 80:
 
                  
 
                  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Gel Extraction</p>
+
                     <p>Bacterial stocks</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
Line 94: Line 92:
 
                  
 
                  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Ligation</p>
+
                     <p>DNA extraction from bacterial culture</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
Line 106: Line 104:
 
                  
 
                  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Liquid Culture</p>
+
                     <p>Enzymatic digestion</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
Line 119: Line 117:
 
                  
 
                  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Midiprep for plasmid extraction</p>
+
                     <p>Electrophoresis on agar gel</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
Line 132: Line 130:
 
                  
 
                  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Miniprep for plasmid extraction</p>
+
                     <p>DNA Gel extraction</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
Line 144: Line 142:
 
                  
 
                  
 
                 <div class="vignette_text">
 
                 <div class="vignette_text">
−
                     <p>Transformation of E. coli BL21 (DE3) pLysS</p>
+
                     <p>Ligation of plasmid with DNA insert</p>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
  
  
−
            <div class="vignette" id="vign_1008">
+
 
−
                <div class="vignette_for" id="for_1008">
+
 
−
                </div>
+
−
               
+
−
                <div class="vignette_back" id="back_1008">
+
−
                </div>
+
−
               
+
−
                <div class="vignette_text">
+
−
                    <p>Transformation of E. coli DH5-alpha</p>
+
−
                </div>
+
−
            </div>
+
  
 
             <div class="panel" id="pan_1000" style="text-align:left;">
 
             <div class="panel" id="pan_1000" style="text-align:left;">
Line 166: Line 155:
 
                 <br>
 
                 <br>
 
                 <h3>Aim</h3>
 
                 <h3>Aim</h3>
−
                 <p> Prepare an 8% agarose gel for the electrophoresis of DNA samples. </p>
+
                 <p>Insert a plasmid of interest into competent bacterial cells, in order to replicate them.</p>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
−
                <h3>Materials</h3>
+
            </div>
−
                <ul>
+
 
−
                    <li> UltraPure™ Agarose (Invitrogen, 16500-100) </li>
+
            <div class="panel" id="pan_1001" style="text-align:left;">
−
                    <li> UltraPure™ 10X TAE Buffer (Invitrogen, 15558) </li>
+
                 <div class="close_button">
−
                    <li> Gel Green Nucleic Acid Stain (Biotium, 41005) </li>
+
                 </div>
−
                    <li> Scale </li>
+
−
                    <li> Microwave </li>
+
−
                    <li> Spatula  </li>
+
−
                    <li> Erlenmeyer (250 mL) </li>
+
−
                    <li> Measuring cylinder </li>
+
−
                    <li> PowerPac™ Basic (Bio-Rad, 1645050) </li>
+
−
                    <li> Mini-Sub® Cell GT Horizontal Electrophoresis System (Bio-Rad, 1704406) </li>
+
−
                 </ul>
+
−
                <br>
+
−
                <h3>Procedure</h3>
+
−
                <br>
+
−
                <ol>
+
−
                    <li> Prepare 600 mL of TAE 1X by diluting 60mL of 10X buffer in 540mL of deionized water. </li>
+
−
                    <li> Weigh 0,6 g of agarose on a scale. </li>
+
−
                    <li> Place the agarose in an Erlenmeyer. </li>
+
−
                    <li> Fill the Erlenmeyer with 75 mL of TAE 1X. </li>
+
−
                    <li> Heat the Erlenmeyer for 2 min 30 s at 350W. </li>
+
−
                    <li> Mix and place it again in the microwave for an additional minute.  </li>
+
−
                    <li> Let the mixture cool down a little bit and add 5 μL of Gel Green. </li>
+
−
                    <li> Pour the agarose in the horizontal electrophoresis system. Don’t forget to place the comb before!  </li>
+
−
                    <li> Let the gel cool down for 20-30 minutes before deposing the samples. </li>
+
−
                 </ol>
+
 
                 <br>
 
                 <br>
 +
                <h3>Aim</h3>
 +
                <p>Grow a colony that have successfully been transformed with one or several plasmids in order to replicate plasmid or to express a protein.</p>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
−
             </div>  
+
             </div>
  
−
             <div class="panel" id="pan_1001" style="text-align:left;">
+
             <div class="panel" id="pan_1002" style="text-align:left;">
 
                 <div class="close_button">
 
                 <div class="close_button">
 
                 </div>
 
                 </div>
Line 210: Line 179:
 
                     <li> Desired bacterial cultures on petri dish  </li>
 
                     <li> Desired bacterial cultures on petri dish  </li>
 
                     <li> Sterile LB media  </li>
 
                     <li> Sterile LB media  </li>
−
                     <li> Accurate antibiotics: Carbenicillin (50 mg/mL) or Chloramphenicol (25 mg/mL)  </li>
+
                     <li> chloramphenicol (25mg/mL) or carbenicilline(50mg/mL)  </li>
−
                     <li> Glycerol 50% </li>
+
                     <li> glycerol 50%  </li>
−
                    <li> Dry Ice  </li>
+
−
                    <li> Falcon 15 mL and 50 mL  </li>
+
−
                    <li> Erlenmeyer 125 mL  </li>
+
−
                    <li> Sterile cryotube  </li>
+
−
                    <li> Inoculation loop  </li>
+
−
                    <li> Pipette p200 + p20 and associated cones  </li>
+
−
                    <li> Plastic graduated pipette (25 mL)  </li>
+
−
                    <li> Electric Pipetman </li>
+
 
                 </ul>
 
                 </ul>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
Line 231: Line 192:
 
                     <li> In 15 ml sterile falcon, add 5 mL of LB media  </li>
 
                     <li> In 15 ml sterile falcon, add 5 mL of LB media  </li>
 
                     <li> Vortex the stock solution of antibiotic and add 5 µL to the LB  </li>
 
                     <li> Vortex the stock solution of antibiotic and add 5 µL to the LB  </li>
−
                     <li> Using an inoculation loop, gently touch a colony of transformed bacteria from the petri dish, plastic side facing you.  </li>
+
                     <li> Using an inoculation loop, touch gently a colony of transformed bacteria from the petri dish, plastic side facing you.  </li>
 
                     <li> Immerse and dip the inoculation loop in the liquid media and stir.  </li>
 
                     <li> Immerse and dip the inoculation loop in the liquid media and stir.  </li>
−
                     <li> Place the liquid culture in the incubator at 37˚C and 180 rpm for 16 h.  </li>
+
                     <li> Place the liquid culture in the incubator at 37˚C 180 rpm for 16h.  </li>
−
                     <li> After 16 h, centrifuge the tubes 5 minutes at 3000 rpm.  </li>
+
                     <li> After 16 hours, centrifuge the tubes 5 minutes at 3000 rpm.  </li>
 
                     <li> Discard supernatant. </li>                     
 
                     <li> Discard supernatant. </li>                     
−
                     <li> Resuspend the pellet in 5 mL of LB.  </li>
+
                     <li> Resuspend the pellet in 5mL of LB.  </li>
 
                     <li> Discard supernatant.  </li>
 
                     <li> Discard supernatant.  </li>
−
                     <li> Resuspend the pellet in 1 mL of fresh sterile LB medium + desired antibiotic </li>
+
                     <li> Resuspend the pellet in 1 mL of LB + antibiotic.  </li>
−
                     <li> In a 125 mL Erlenmeyer, add 1 mL of bacterial culture in 24 mL of LB + desired antibiotic.  </li>
+
                     <li> In a 125 ml erlenmeyer, add 1 mL of bacterial culture in 24 mL of LB + antibiotic.  </li>
−
                     <li> Incubate the culture at 37°C and 180 rpm. </li>
+
                     <li> Incubate the culture at 37˚C 180 rpm. </li>                  
−
                     <li> Measure the OD every hour for the first 3 h and then every 20 minutes.  </li>
+
                     <li> Measure the OD every hour for the first 3 hours and then every 20 minutes.  </li>
−
                     <li> When the OD reaches 0.6 to 0.7, withdraw 5 mL of the bacterial liquid culture and add 5 mL of glycerol 50%. </li>
+
                     <li> When 0,6 < OD < 0,7, withdraw 5 mL of the bacterial liquid culture and add 5 mL of glycerol 50 %.   </li>
−
                     <li> Vortex the tube. </li>
+
                     <li> Vortex. </li>
 
                     <li> Aliquot the 10 mL into sterile cryotubes. </li>
 
                     <li> Aliquot the 10 mL into sterile cryotubes. </li>
−
                     <li> Place into dry ice and freeze at -80°C. </li>
+
                     <li> Place into dry ice and freeze at -80˚C. </li>
 
                 </ol>
 
                 </ol>
 
                 <br>
 
                 <br>
−
                 <br>  
+
                <div class="protocol_box">
 +
                    <p> <a href="" target="_blank">Get full protocol here</a> </p>
 +
                </div>
 +
                 <br>
 
             </div>
 
             </div>
  
−
 
+
             <div class="panel" id="pan_1003" style="text-align:left;">
−
             <div class="panel" id="pan_1002" style="text-align:left;">
+
 
                 <div class="close_button">
 
                 <div class="close_button">
 
                 </div>
 
                 </div>
 
                 <br>
 
                 <br>
 
                 <h3>Aim</h3>
 
                 <h3>Aim</h3>
−
                 <p> Extract a specific DNA band from an agarose electrophoresis gel. </p>
+
                 <p>Retrieve amplified plasmids from a liquid culture of transformed bacteria. According to the liquid culture volume, we used the QIAfilter Plasmid Purification kit (for 25 mL culture) or the QIAprep Spin Miniprep kit (for 5 mL culture) from Qiagen.</p>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
−
                <h3>Materials</h3>
+
            </div>
−
                <ul>
+
 
−
                    <li> QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, 28706) </li>
+
            <div class="panel" id="pan_1004" style="text-align:left;">
−
                    <li> Scale </li>
+
                 <div class="close_button">
−
                    <li> Scalpel </li>
+
                 </div>
−
                    <li> Heating block </li>
+
−
                    <li> Water bath </li>
+
−
                </ul>
+
−
                <br>
+
−
                <h3>Procedure</h3>
+
−
                <br>
+
−
                <p> According to the <a href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=3987caa6-ef28-4abd-927e-d5759d986658&lang=en"> QIAquick Gel Extraction Kit's manual </a> </p>
+
−
                 <ol>
+
−
                    <li> Using a UV light, excise the DNA fragment from the agarose gel with a clean, sharp scalpel.  </li>
+
−
                    <li> Weigh the gel slice in a colorless tube. Add 3 volumes of Buffer QG to 1 volume of gel (100 mg ~ 100 μL).  </li>
+
−
                    <li> Incubate at 50°C for 10 minutes (or until the gel slice has completely dissolved). To help dissolve the gel, mix by vortexing the tube every 2 to 3 minutes during the incubation.  </li>
+
−
                    <li> After the gel slice has dissolved completely, check that the color of the mixture is yellow (similar to Buffer QG without dissolved agarose).  </li>
+
−
                    <li> Add 1 gel volume of isopropanol to the sample and mix.  </li>
+
−
                    <li> To bind DNA, pipet the sample onto the QIAquick column and apply vacuum. After the sample has passed through the column, switch off the vacuum source.  </li>
+
−
                    <li> (Optional): Add 0.5 mL of Buffer QG to QIAquick column and apply vacuum.  </li>
+
−
                    <li> To wash the column, add 0.75 mL of Buffer PE to QIAquick column and apply vacuum.  </li>
+
−
                    <li> Transfer QIAquick column to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube or to a provided 2ml collection tube. Centrifuge for 1 minutes at 13,000 rpm (~17,900 x g).  </li>
+
−
                    <li> Place QIAquick column in a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.  </li>
+
−
                    <li> To elute DNA, add 50 μL of Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) or H2O to the centre of the QIAquick membrane and centrifuge the column for 1 minute at 13,000 rpm (~17,900 x g). Alternatively, for increased DNA concentration, add 30 μL elution buffer, let stand for 1 min, and then centrifuge for 1 minute.  </li>
+
−
                 </ol>
+
 
                 <br>
 
                 <br>
 +
                <h3>Aim</h3>
 +
                <p>Perform restriction enzyme digestion in order to recover linear backbones of the plasmids, extract our inserts from commercial plasmid, or check the success of a ligation. </p>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
−
             </div>                        
+
             </div>
  
−
             <div class="panel" id="pan_1003" style="text-align:left;">
+
             <div class="panel" id="pan_1005" style="text-align:left;">
 
                 <div class="close_button">
 
                 <div class="close_button">
 
                 </div>
 
                 </div>
 
                 <br>
 
                 <br>
 
                 <h3>Aim</h3>
 
                 <h3>Aim</h3>
−
                 <p> To perform the ligation of one or more inserts in a plasmid using the In-Fusion cloning kit. </p>
+
                 <p>Separate DNA fragments according to their molecular weight after an enzymatic digestion, in order to purify inserts or to analyse a plasmid.</p>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
−
                <h3>Materials</h3>
+
             </div>
−
                <ul>
+
−
                    <li> Stellar Competent cells (Takara Clontech) </li>
+
−
                    <li> Linearized plasmid </li>
+
−
                    <li> Purified insert(s) </li>
+
−
                    <li> 5X In-Fusion HD Enzyme Premix (Takara Clontech) </li>
+
−
                    <li> Control plasmid pUC19 </li>
+
−
                    <li> Control insert </li>
+
−
                    <li> Deionized water </li>
+
−
                    <li> Water bath at 50°C </li>
+
−
                    <li> 1.5 mL Eppendorf tubes </li>
+
−
                    <li> Heating block at 80°C </li>
+
−
                    <li> Dry ice </li>
+
−
                </ul>
+
−
                <br>
+
−
                <h3>Procedure</h3>
+
−
                <br>
+
−
                <ol>
+
−
                    <li> Set the mix between insert and linearized vector in molar ratio 2:1 and complete with distilled water to reach a reaction volume of 16 µL. The optimal quantity of vector is 100-150 ng. </li>
+
−
                    <li> Pre-heat vector and insert for 5 minutes at 80°C. </li>
+
−
                    <li> Put on ice for 3 minutes. </li>
+
−
                    <li> Add 4 µL 5X In-Fusion HD Enzyme Premix and let the cloning occur in a water bath at 50°C. </li>
+
−
                    <li> Set on ice and proceed to transformation in Stellar competent cells. </li>
+
−
                </ol>
+
−
                <br>
+
−
                <br>
+
−
             </div>  
+
  
−
             <div class="panel" id="pan_1004" style="text-align:left;">
+
             <div class="panel" id="pan_1006" style="text-align:left;">
 
                 <div class="close_button">
 
                 <div class="close_button">
 
                 </div>
 
                 </div>
 
                 <br>
 
                 <br>
 
                 <h3>Aim</h3>
 
                 <h3>Aim</h3>
−
                 <p> </p>
+
                 <p>: Extract DNA from an agar gel after an electrophoresis. We used the QIAquick Gel Extraction Kit provided by Qiagen.</p>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
−
                <h3>Materials</h3>
+
             </div>
−
                <ul>
+
−
                    <li>  </li>
+
−
                </ul>
+
−
                <br>
+
−
                <h3>Procedure</h3>
+
−
                <br>
+
−
                <ol>
+
−
                    <li>  </li>
+
−
                </ol>
+
−
                <br>
+
−
                <br>
+
−
             </div>  
+
  
−
             <div class="panel" id="pan_1005" style="text-align:left;">
+
             <div class="panel" id="pan_1007" style="text-align:left;">
 
                 <div class="close_button">
 
                 <div class="close_button">
 
                 </div>
 
                 </div>
 
                 <br>
 
                 <br>
 
                 <h3>Aim</h3>
 
                 <h3>Aim</h3>
−
                 <p> </p>
+
                 <p>Insert a DNA fragment with appropriate overlaps into a linearized plasmid. We used the In-Fusion HD Cloning Plus provided by Ozyme. </p>
 
                 <br>  
 
                 <br>  
−
                <h3>Materials</h3>
+
             </div>
−
                <ul>
+
                                 
−
                    <li>  </li>
+
−
                </ul>
+
−
                <br>
+
−
                <h3>Procedure</h3>
+
−
                <br>
+
−
                <ol>
+
−
                    <li>  </li>
+
−
                </ol>
+
−
                <br>
+
−
                <br>
+
−
             </div>  
+
  
 
             <script>      /*vignette animation*/
 
             <script>      /*vignette animation*/
Line 487: Line 383:
 
                                 act_vign.style.order="16";
 
                                 act_vign.style.order="16";
 
                                 act_pan.style.order="19";  
 
                                 act_pan.style.order="19";  
−
                                 break;  
+
                                 break;                        
−
                            case '08':
+
−
                                act_vign.style.order="17";
+
−
                                act_pan.style.order="20";
+
−
                                break;                     
+
 
                         }
 
                         }
 
                     }
 
                     }
Line 532: Line 424:
 
                                 act_vign.style.order="16";
 
                                 act_vign.style.order="16";
 
                                 act_pan.style.order="17";  
 
                                 act_pan.style.order="17";  
−
                                 break;    
+
                                 break;                            
−
                            case '08':
+
−
                                act_vign.style.order="18";
+
−
                                act_pan.style.order="19";
+
−
                                break;                         
+
 
                         }
 
                         }
 
                     }     
 
                     }     
Line 577: Line 465:
 
                                 act_vign.style.order="16";
 
                                 act_vign.style.order="16";
 
                                 act_pan.style.order="18";  
 
                                 act_pan.style.order="18";  
−
                                 break;  
+
                                 break;                            
−
                            case '08':
+
−
                                act_vign.style.order="19";
+
−
                                act_pan.style.order="20";
+
−
                                break;                         
+
 
                         }
 
                         }
 
                     }
 
                     }

Revision as of 16:10, 13 September 2018

""

Molecular Biology: general protocols

Here we present the basic molecular biology methods we used throughout the project to amplify our plasmids, linearize them and insert our sequences, retrieve them from bacteria and express proteins.

Bacteria transformation

Liquid culture

Bacterial stocks

DNA extraction from bacterial culture

Enzymatic digestion

Electrophoresis on agar gel

DNA Gel extraction

Ligation of plasmid with DNA insert


Aim

Insert a plasmid of interest into competent bacterial cells, in order to replicate them.



Aim

Grow a colony that have successfully been transformed with one or several plasmids in order to replicate plasmid or to express a protein.



Aim

Stock bacterial culture at -80 °C.


Materials

  • Desired bacterial cultures on petri dish
  • Sterile LB media
  • chloramphenicol (25mg/mL) or carbenicilline(50mg/mL)
  • glycerol 50%

Procedure

In advance:

  • Prepare a stock solution of LB + desired antibiotic in 50 mL falcon tube depending on how many culture you would like to stock in glycerol.
  • Prepare a sterile stock solution of glycerol 50 %.
  1. In 15 ml sterile falcon, add 5 mL of LB media
  2. Vortex the stock solution of antibiotic and add 5 µL to the LB
  3. Using an inoculation loop, touch gently a colony of transformed bacteria from the petri dish, plastic side facing you.
  4. Immerse and dip the inoculation loop in the liquid media and stir.
  5. Place the liquid culture in the incubator at 37˚C 180 rpm for 16h.
  6. After 16 hours, centrifuge the tubes 5 minutes at 3000 rpm.
  7. Discard supernatant.
  8. Resuspend the pellet in 5mL of LB.
  9. Discard supernatant.
  10. Resuspend the pellet in 1 mL of LB + antibiotic.
  11. In a 125 ml erlenmeyer, add 1 mL of bacterial culture in 24 mL of LB + antibiotic.
  12. Incubate the culture at 37˚C 180 rpm.
  13. Measure the OD every hour for the first 3 hours and then every 20 minutes.
  14. When 0,6 < OD < 0,7, withdraw 5 mL of the bacterial liquid culture and add 5 mL of glycerol 50 %.
  15. Vortex.
  16. Aliquot the 10 mL into sterile cryotubes.
  17. Place into dry ice and freeze at -80˚C.

Get full protocol here



Aim

Retrieve amplified plasmids from a liquid culture of transformed bacteria. According to the liquid culture volume, we used the QIAfilter Plasmid Purification kit (for 25 mL culture) or the QIAprep Spin Miniprep kit (for 5 mL culture) from Qiagen.



Aim

Perform restriction enzyme digestion in order to recover linear backbones of the plasmids, extract our inserts from commercial plasmid, or check the success of a ligation.



Aim

Separate DNA fragments according to their molecular weight after an enzymatic digestion, in order to purify inserts or to analyse a plasmid.



Aim

: Extract DNA from an agar gel after an electrophoresis. We used the QIAquick Gel Extraction Kit provided by Qiagen.



Aim

Insert a DNA fragment with appropriate overlaps into a linearized plasmid. We used the In-Fusion HD Cloning Plus provided by Ozyme.