前言

在鑑定一個病害致病的病原上，最早由德國細菌學家 Robert Koch 對肺結核病之研究開發出一套方法確認結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）為該病病原，開啟病原性(pathogenicity) 研究的之先河。以植物病理學領域而言，由美國植物病理學家 Erwin F. S. 於 190l年提出，在植病上的柯霍氏法則包括了：在病株罹病部位經常可以發現可能的病原菌；病原菌可被分離並在培養基中進行培養，並記錄各項特徵；純培養的病原菌應接種至與病株相同品種的健康植株，並產生與病 株相同的病徵；從接種的病株上以相同的分離方法應能再分離（reisolate）出病原，且其特徵與由原病株分離者應完全相同。Erwin 所修改的植物病原柯霍式法則後來廣為應用於植物病理學的研究範疇(7, 5)。在植病柯霍式法則的施行上，最重要的是要能從罹病植物組織上分離到疑似的致病原如此才能進一步確立病原相關性，而分離(isolation)的目的就是先純化所分離到的潛在病原菌(pathogen)，並排除其他非病原的微生物，大量純化培養(propagation)目標病原菌後以確立其病原性。依照不同病組織以及病原菌特性，分離的方式大致可分為以下五種。一、組織分離法(Tissue plating method)：取下罹病組織，並表面消毒後，進行培養並純化潛在病原菌；二、稀釋平板法(Dilution plate method)：通常用於鑑定土壤中的病原菌，將病土(disease soil) 經過序列稀釋培養後，再進一步挑選純化；三、劃線平板法(Streak plate method)：用於病原細菌的純化，目標係純培養出單一菌落(single colony)，以利後續的純培養(pure culture)；四、單孢分離法(Single spore isolation)：專用於病原真菌的分離，刺激並組織上病原真菌產包後，挑取單一孢子進行培養；五、寄主篩選法(誘釣法)(Baiting method)：利用適當的寄主植物組織感染病原菌，篩選掉其他非病原的腐生菌，便於針對特定病原純化(7)。白菜炭疽病之病原菌為真菌，Colletotrichum higginsianum所引起的病害，該病菌會隨病殘體在土中或附在種子上越冬，借風或雨水飛濺傳播。主要造成葉片或花梗表面斑駁病透化壞疽甚至脫落。在光學顯微鏡底下可以觀察其菌絲透明無隔膜，分生孢子為長橢圓狀，具油滴，產生於瓶狀枝之產孢細胞(conidiogenous cell)(3)。水稻紋枯病為水稻重要病害之一，於世界各地普遍發生，其病原菌為立枯絲核菌無性世代之其中一群──Rhizoctonia solani AG 1-IA。主要危害單子葉禾本科植物葉鞘、莖以及花穗，引起虎斑狀紋枯病，無性世代之菌絲特徵為分枝基部縊縮，並與主軸呈直角 ^{2, 4} 。疫病係由卵菌綱(Oomycetes)之Phytophthora sp. 所引起之病害，寄主範圍廣泛。疫病菌平常靠菌絲或厚膜孢子存活於土壤、或其他寄主植物上，等降雨致土壤濕度飽和時，病菌產生具有乳突(papilla)之胞囊(sporangia)及游走子(zoospore)。游走子可在水中游泳。胞囊與游走子可藉風雨吹送、或小動物之攜帶至果實或其他果園，侵入感染，誘發病害。傳統上鑑定植體上是否被疫病菌污染，可經由病徵檢定與誘釣、分離技術來判斷(1)。本實驗目標為利用組織分離法分離水稻紋枯病(sheath blight)之病源真菌Rhizoctonia solani AG 1-IA (anamorph)和白菜炭疽病(Cruciferous vegetable anthracnose ) 之病原真菌Colletotrichum higginsianum，並以光學顯微鏡觀察病原，確認是否成功分離。誘釣法則以茄子果實組織，誘釣病土中的疫病菌(Phytophthora sp.)，將罹病組織培養於適當培養環境，待病原菌於培養基上長出後，置於光學顯微鏡底下觀察病原菌型態是否符合文獻所述，即柯霍式法則在確認病原的分離步驟之實施。材料方法組織分離法中，水稻紋枯病病原分離為先取疑似罹病之水稻，將其病、健交界處以病部：健部為2：1的比例切下，以1%氯水分別進行不同時間之表面消毒，分別為：不消毒、30秒、1分鐘、3分鐘，再以無菌水潤洗3次，每次3分鐘；之後將組織放置於2% WA medium (agar 20g/L)上於28度C培養四天後，以移植針取下菌絲末端菌絲塊，放置於PDA medium (potato starch 4g/L, Dextrose 20g/L, Agar 15g/L)上培養一週並觀察菌株生長情況；白菜炭疽病部分則仿照前述方法進行分離。待培養一週後刮取菌落表面，於光學顯微鏡底下鏡檢，鑑定病原菌之菌絲與孢子型態。寄主篩選法使用茄子果實進行病原菌(卵菌)誘釣。先以75%酒精將茄子果實進行表面消毒後，使用解剖刀每隔5 cm 切下1 cm X 1 cm 組織後，取少許病土塞入孔洞，再將切下組織填塞回去並且以膠帶固定，將茄子果實置於濕潤的夾鏈袋中培養、觀察果實褐化情形。四天後切取褐化組織至V8 medium(V8 juice 100ml/L, CaCO3 2g/L, Agar 20g/L )上培養一週後，以移植棒刮取表面菌絲，於光學顯微鏡下鏡檢，觀察其孢囊型態。結果與討論組織分離法在白菜炭疽病上，將罹病白菜葉片病、健交接處組織塊處理不同消毒時間後，置於WA培養基培養四天，可觀察到在不同的消毒時間處理後的組織塊周邊皆有擴散出菌絲，但菌絲生長範圍不同，以一分鐘處裡的範圍最廣，另外組織塊上有略呈橘黃色應是分生孢子堆的構造(圖一、A)；將菌絲末端菌絲塊移至PDA培養基上兩天後，不同的消毒時間處理組之菌絲塊周邊皆長出不規則菌絲及菌落，隨著消毒時間的不同，生長出的菌落大小、形狀、延伸程度皆有所差異，菌絲塊上有略呈現橘黃色之構造，以消毒30秒處理最為明顯(圖一、B)。刮取橘黃色可能為分生孢子堆的構造至光學顯微鏡下觀察可以看到正在分化的分生孢子(圖一、C，D)；另取較成熟的分生孢子做比較，可以看到橢圓、中央有油滴的構造，為典型的炭疽病菌分生孢子(圖一、E)(6)。在水稻紋枯病上，將罹病水稻葉之病、健交接處組織塊處理不同消毒時間後，置於WA培養基培養四天，可觀察到在不同的消毒時間處理後的組織塊周邊皆有擴散出菌絲，但菌絲生長範圍不同，較長處理時間之菌絲較較短時間處理之菌絲範圍大，可能紋枯病病原菌之耐受性較佳(圖二、A)；將菌絲末端菌絲塊移至PDA培養基上兩天後，不同的消毒時間處理組之菌絲塊周邊皆長出不規則菌絲及乳黃色物體，消毒時間較久之組別上出現乳黃色物體之情形極明顯，幾無法觀察到白色菌絲(圖二、B)。刮取菌絲於光學顯微鏡底下觀察，可發現有隔膜的分枝狀菌絲與主軸菌絲有近垂直的情況，且基部縊縮，與紋枯病文獻所載病原型態類似，可能成功分離出病原菌(圖二、C)(4)。但同時也觀察到某些樣本菌絲附近有游動桿狀物，可能為桿狀細菌，故乳黃色物體可能為非目標雜菌。在寄主篩選法中，目標是分離檢測疫病病原菌，病從感染組織中分離到菌，經培養後可觀察到顯微鏡底下具有典型疫病菌的孢囊構造。傳統上鑑定疫病菌可以透過病癥(symptom)與病兆(sign)鑑定或誘釣法，疫病菌係以水濺傳播遊走孢子做為主要二次傳染途徑，於組織上一開始產生水浸狀斑塊，然後褐化最後腐爛，後期於高濕環境下則於病斑處長出白色黴狀物，乃為其菌絲以及孢囊。分別以取自瓜類、木瓜、茄子、芋頭四種作物之田間土壤塞入茄子果實進行接種，培養四天並觀察，多在三至四天才出現明顯褐化、軟腐甚至長出白色菌絲的情形。以種植瓜類土壤接種，多有使茄子呈現褐化病徵，且有白色菌絲生長於表面(圖三、A)；以種植木瓜土壤接種，無出現病徵(圖三、B)；以種植茄子土壤接種雖有出現褐化病徵，但僅觀察到卵菌之菌絲(圖三、C)；以種植芋頭土壤接種，多有使茄子呈現褐化病徵，且有白色菌絲生長於表面(圖三、D)。在生長四天後，切下茄子上褐化組織與健康組織交接處組織塊，於V8培養基上培養兩天，並挑取菌絲至光學顯微鏡觀察。以未出現明顯病徵之木瓜土壤處理而言，可以觀察應為細菌之串連桿狀菌體(圖三、E)、分支狀具隔膜之菌絲(圖三、F)、分支狀不具隔膜之菌絲(圖三、G)，以及怪異分枝狀不明菌(圖三、H)。以出現明顯病徵且有白色菌絲長於表面之芋頭土壤處理進行光學顯微鏡觀察，可觀察到如文獻所述，前端具乳突之卵菌孢囊構造(圖三、I)(1)。在各土壤處理中，有出現褐化及表面出現菌絲之組別，如瓜類及芋頭土壤組，皆觀察到目標卵菌孢囊構造。而僅出現褐化之茄子土壤組，就僅觀察到可能為目標卵菌之菌絲，這有兩種可能，一是其所釣到並非疫病病原菌，而為其他菌種；二則為該菌生長較慢，未能在相同接種時間觀察到孢囊構造。在未出現病徵之木瓜土壤組則出現各式菌。然而疫病菌引起之病徵特殊，在分離鑑定疫病菌尚需有可能與腐霉菌(Pythium spp.)混淆，兩者造成病徵相似，病原菌型態亦雷同；但最大之差異在於疫病菌間接發芽時，遊走孢子的分化是在胞囊中進行，而腐霉菌則是胞囊的先端先長出 extrusion tubes 與 viscles，原生質在 viscles內分化。在鑑別時若能於顯微鏡底下直接觀察到游走孢子釋放即可辨別二者，或是以特定之鑑別性培養基培養。另外若要細分區分不同疫病病菌之分類屬上，可依胞囊、有性器官、生長溫度、菌絲膨脹體、厚膜胞子、菌落形態、寄主與病原性等進行細分；若輔以分子層級鑑定則能更精準判定 ¹ 。

參考文獻